بیماری آنفولانزای طیور

تاریخچه :

این بیماری كه سبب مرگ ومیربالایی در پرندگان عفونی می شود برای اولین بار در سال 1878 ،بیش از صد سال پیش در ایتالیا شناخته شد . تا اوائل سال 1901 نشان داده شد كه میکروارگانیسم عامل این بیماری یك ویروس می باشد اما هنوز تا سال 1955 ارتباط بین این بیماری و دیگر ویروسهای ملایم جدا شده از پرندگان با ویروسهای آنفولانزایA پستانداران مشخص نشده بود(برای اولین باردردهه930 ) .
آنفولانزای مرغی در ایالت متحده در سال 25 ـ 1924 شایع شد و در سال 1929 دوباره این شیوع رخ داد در حالی كه هر دوبار ریشه كن شد .
یك پاندمی بزرگ از آنفولانزای مرغی بسیار پاتوژن در شمال شرقی ایالت متحده در سال 84 ـ 1983 رخ داد . بیش از دو سال وقت و70 میلیون دلار هزینه برای ریشه كنی آن صرف گردید و بطور تخمینی 17میلیون پرنده طی برنامه ریشه كنی معدوم شدند .
فقط ویروسهای آنفولانزای تیپ A بعنوان عوامل طبیعی عفونت زائی در پرندگان شناخته شده بودند در حالی كه 9 تحت تیپ NA و15 تحت تیپ HA از آنفولانزای تیپA كه به احتمال خیلی زیاد به صورت تركیبی با هم می باشند از گونه های مختلف پرندگان جدا شده اند .
ایالت متحده هیچ شیوع وسیعی از سال 1986 نداشته است اگر چه سویه های كم پاتوژن در حال حاضر وجود دارند وخسارات قابل توجه ای نیزبه بارمی آوردند.
در سال 97 ـ 1996 تعدادی از مزرعه های تخم گذار در مناطق لبانون و لنكستر تیتر PA آنها برای آنفولانزای مرغی H7N2 مثبت شد . این سویه برای جوجه ها غیر بیماری زا بود ولی دارای اثرات وسیع مخرب برروی صنعت طیور بود .
در سال 1994 یك شیوع آنفولانزای مرغی در مكزیك رخ داد كه به صورت ملایم و خفیف شروع شد اما در اثر موتاسیون به یك ویروس كشنده تبدیل شد وسبب تلفات سنگینی در گله طیور گوشتی گشت .
یك سناریوی مشابه در شمال شرقی ایالت متحده در اواسط 1980 رخ داد .
سرو تایپ بسیار پاتوژنی كه سبب شیوع در سالهای 84 ـ 1983 در ایالت متحده و مكزیك گردید H5N2 نام داشت .
از نظر تاریخی ، سروتایپهای H5 و H7 با بیماری های با حدت بالا در طیور همراه هستند .

پرندگان وحشی :

اولین جداسازی ویروس آنفولانزاازپرندگان شكاری درسال1961 از پرستوهای معمولی (stema hirundo) در جنوب آفریقا صورت گرفت ، اما تا اواسط دهه1970 هیچ گونه تحقیق سیستماتیكی برروی آنفولانزا در پرندگان شكاری انجام نگرفت بود . شواهد نشان می دهند كه مخازن مهم ویروسهای آنفولانزا پرندگان شكاری می باشند و ویروس می تواند در این جمعیت ها پایدار بماند .

پرندگان قفسی :

از سال 1975 زمانی كه اولین جداسازی از پرندگان قفسی به ثبت رسید مشخص شد كه تمامی نمونه های جداشده از پرندگان قفسی بطور عمده از تحت تیپ H3 و H4 می باشند .ویروسهای آنفولانزای مرغی بطور عمده از گونه های گنجشكیان جدا می شوند و به ندرت گونه های طوطی سانان (psittacin) را درگیر می سازند .
گر چه در صورت وجود ویروسهای آنفولانزا در پرندگان یك منطقه موقع خروج آن از كشور حتی تا سالها بعد ازجدا نشدن ویروس ازآن منطقه پرندگان رادرقرنطینه برای مدت دوره كمون تحت مراقبت نگه می دارند.
مثالهای تأئیدشده ای از عفونت های انسانی با ویروسهای آنفولانزا از سال 1997:
1997:در هنگ كنگ ، آنفولانزای مرغی تیپA (H5N1)هم جوجه ها هم انسانها را عفونی ساخت ، این اولین باری بود كه ویروس آنفولانزای مرغی مستقیماُ از پرندگان به انسان منتقل می شد .
طی این شیوع 18 نفر بستری شدند و 6 نفر از آنها از بین رفتند .برای كنترل شیوع مسئولین تقریباُ 5/1 میلیون جوجه را از بین بردند برای اینكه مخزن ویروس را از بین ببرند. دانشمندان نشان دادند كه ویروس ها ابتدا از طریق پرندگان در میان انسانها شایع شدند وانتقال شخص به شخص كمتر مورد توجه می باشد .

احتمال پاندمیك شدن یك آنفولانزای مرغی :

تمامی ویروسهای آنفولانزا توانایی تغییر را به طور بالقوه دارا می باشند . این مسئله احتمال دارد كه ویروس آنفولانزای مرغی تغییر پیدا كند و توانایی آلوده ساختن انسان را پیدا كند و براحتی از شخص به شخص منتقل شود . بدلیل اینكه این ویروسها به طور معمول انسانها را عفونی نمی سازند باعث شده كه در میان جمعیت انسانی هیچ مصونیتی یا به میزان خیلی كمی مصونیت در برابر آنها وجود داشته باشد . اگر یك ویروس آنفولانزای مرغی قادر باشد انسانها را آلوده سازد وبراحتی از شخص به شخص منتقل شود یك پاندمی آنفولانزا می تواند پیش آید . پاندمی های گذشته آنفولانزا سبب مرگ ومیر وخسارات اقتصادی بالایی شده اند .

در قرن بیستم 3 پاندمی رخ داده است :

1-1919 ـ 1918 :آنفولانزای اسپانیایی : A(H1N1) ، سبب بالاترین مرگ ومیر شده بیش از 500000 نفر در ایالت متحده و 20 تا 50 میلیون نفر احتمالاُ در تمام دنیا از بین رفتند . تعداد زیادی در همان روز اول بعد از عفونت وبقیه از عوارضی كه خیلی زود ظاهر می شدند در گذشتند . تقریباُ نیمی از آنها جوان و بالغین سالم بودند .
2-1958 ـ1957 :آنفولانزای آسیایی : A(H2N2) سبب حدود 70000 مرگ ومیر در ایالت متحده شده است . اولین بار در كشور چین در اواخر فوریه 1957 شناسایی شد وآنفولانزای آسیایی تا ژوئن 1957 در ایالت متحده منتشر شد .
3-1969 ـ 1968 :آنفولانزای هنگ كنگی : A(H3N3) سبب به طور تخمینی 34000 مورد مرگ ومیر در ایالت متحده گردید . این ویروس اولین بار در هنگ كنگ در اوائل 1968 شناسایی شد وتا اواخر سال به ایالت متحده سرایت كرد . تیپ A(H3N3) هنوز تا امروز نیز در چرخش است . وقتی كه یك پاندمی آنفولانزای ویروسی پدید می آید آن ویروس در میان جمعیت های انسانی مستقر می گردد و برای سالها به چرخه زندگی خود ادامه می دهد . مركز كنترل بیماری های US و سازمان بهداشت جهانی دارای برنامه های وسیعی برای نشان دادن میزان فعالیت آنفولانزا در تمام دنیا می باشند كه شامل رسیدگی سریع به سویه های ویروسی كه احتمال پاندمیك شدن آنها وجود دارد می باشد .
دیگر مثالهای تأئید شده از عفونت آنفولانزای مرغی در انسانها :
1999 :در هنگ كنگ ، مواردی از آنفولانزای مرغی A تیپ (H9N2) در دو كودك تأئید شد كه هر دو بیمار بهبود یافتند و موارد دیگری تأئید نشد . شواهد دال بر این است كه طیور منبع عفونت بودند و راه اصلی انتقال از پرنده به انسان بوده است . اما احتمال انتقال فرد به فرد نیز هنوز باقی می ماند . موارد دیگری از عفونت با H9N2 از mailand چین در طول سالهای 1998 تا 1999 گزارش شد .
2003:آنفولانزای مرغی تیپ A (H7N7) در میان كارگران مرغداری وخانواده هایشان در نیدرلند طی شیوع آنفولانزا در مرغداری ها شایع شده بیش از 80 مورد بیماری گزارش گردید ، (علائم به صورت عفونت چشمی به همراه علائم تنفسی بود) و یك بیمار از بین رفت . شواهدی نیز ازانتقال فرد به فرد وجود داشت .
2003 :عفونتH9N2 در یك كودك در هنگ كنگ تأئید گردید . كودك بستری شد اما بهبود یافت .
همچنین ویروسهای آنفولانزا كه مسئول پاندمیك های 1957 و 1968 بودند بوسیله نوتركیبی ژنتیكی بین انسان و ویروسهای مرغی پدید آمدند .
همزمان با اولین گزارش انتقال داخل گونه ای ویروسهای خوكی به انسان در سال 1974 ، موارد اسپورادیك آن از انسان جدا شد و بیشترین میزان عفونت در سربازان عفونی در اپیدمی fort dix در ایالت متحده در سال 1976 گزارش شد . (4 )
متعاقباُ ، ویروسهای نوتركیب آنفولانزای خوكی به نام ویروس آنفولانزای مرغی ـ انسانی A H3N2 نشان داده شد كه مسئول دو مورد آنفولانزا در بچه های كم سن و سال در netherland در سال 1993 بود . این ویروسهای نوتركیب دارای ژنهای شبه مرغی بودند كه پروتئین های داخلی را كد می كردند و ژنهای شبه انسانی HA و NA را داشتند .

مقدمه :

ویروسهای تیپ A آنفولانزا می توانند تعدادی از رده های حیوانی را شامل : پرندگان، خوكها ، اسبها ، فك و والها را عفونی سازند . ویروسهای آنفولانزائی كه پرندگان راعفونی می سازند ویروسهای آنفولانزای مرغی نامیده می شوند.پرندگان بخصوص دارای اهمیت ویژه ای هستند به دلیل اینكه تمامی تحت تیپهای آنفولانزایA در میان پرندگان وحشی كه میزبانهای طبیعی و با اهمیت و مورد توجه این ویروسها می باشند در چرخه اند .آنفولانزای مرغی بطور معمول مستقیماُ انسانها را عفونی نمی سازند یا اینكه دارای چرخه زندگی در میان انسانها نمی باشند .
آنها را می توان بر اساس قدرت بیماریزائیشان به دو گروه مجزا دسته بندی كرد . ویروسهای بسیارپاتوژن مسبب طاعون پرندگان كه امروزه بخش ویروسهای آنفولانزای بسیار پاتوژن را تشكیل می دهند (HPAT) كه در آن میزان مرگ ومیر ممكن است تا 100% برسد . این ویروسها به تحت تیپهای H5 و H7 محدود می شوند اگر چه تمامی ویروسهای این تحت تیپها سبب HPAI نمی شوند . تمام ویروسهای باقی مانده باعث بروز بیماری ملایم و ابتدائی تنفسی می شوند كه ممكن است بوسیله دیگر عفونتها یا وضعیت های محیطی تشدید گردد .
ویروسهای آنفولانزا تیپ A بر اساس پروتئین های سطحی شان یعنی هماگلوتینین (HA) و نورآمینیداز (NA) تقسیم بندی می شوند . تعداد 15 تا تحت تیپ HA و 9 تا تحت تیپ NA وجود دارد . تمامی گروهها می توانند در پرندگان یافت شوند ولی فقط 3 زیرگروه از HA ) H1وH2 وH3 ( و دو زیر گروه از NA (N1 N2) دارای چرخه زندگی در میان انسانها هستند .
آنفولانزای مرغی معمولاُ پرندگان وحشی را بیمار نمی سازد ولی می تواند پرندگان اهلی را شدیداُ بیمار ساخته وآنها را بكشد . بطور معمول انسانها را عفونی نمی سازند لیكن تعدادی از مثالهای عفونتهای انسانی و شیوع در میان آنها از سال 1997 گزارش شده است .
هنگامی كه چنین عفونتهایی رخ می دهد مسئولین بهداشت جهانی نشان داده اند كه وضعیت و نشانه های بالینی بیماری به آنفولانزای مرغی نزدیك می باشد و این می تواند بطور بالقوه باعث انتشار وسیع عفونت در میان انسانها گردد .
امروزه قوانین وسیع حفظ امنیت زیستی از انتشار ویروس به ایالت متحده و كشورهای همسایه جلوگیری می كند . تلاشهای محققان مستقیماُ برروی اینكه چگونه و چرا ویروسهای پاتوژن تبدیل به ویروسهای بسیار پاتوژن و خطرناك می شوند متمركز می باشد .
این ویروسها دارای RNA ,envelop تك رشته ای منفی كه به تایپهای A وB وC طبقه بندی می شوند هستند.
ژنوم ویروس آنفولانزای A شامل 8قطعه RNA تك رشته ای می باشد كه حداقل 10محصول ژنی راكد می كند .
ماهیت سگمنته ژنوم باعث نوتركیبی ژنها هنگامی كه سویه های مختلف یك میزبان راعفونی می سازد می شود.
نوتركیبی ژنتیكی ، كه منجر به تولید تغییرات آنتی ژنیك در انسانها می شود به عنوان شیفت آنتی ژنیك شناخته می شود . تعدادی از چنین شیفتهای آنتی ژنی تاكنون رخ داده است . برای مثال ، پاندمی وخیم آنفولانزا در 1918 و 1920 بدنبال خود شروع یك عفونت ویروسی در انسانها را با یك ویروس شبه مرغی به نام H1N1 به همراه داشت و مثالهای دیگر كه در تاریخچه ذكر شده است .
انتقال ویروسهای كاملاُ مرغی بطور مستقیم ، بدون هیچ میزبان واسطی مانند خوك تصور می شود كه بوسیله رسپتورهای اختصاصی سلولهای انسانی تعیین گردد . لیكن ، عفونت انسانها با ویروسهای آنفولانزای A مرغی امروزه مستند و ثابت شده است .
مثلاُ تمامی 8 قطعه ژنوم ویروس H5N1 جدا شده از انسانها در سال 1997 منشأ مرغی داشتند و 8 قطعه ژنوم H9N2 جدا شده در سال 1999 نیز مرغی بودند كه 6 قطعه ژنی آن كه تركیبات داخلی را كد می كردند مشابه آنهایی بودند كه در سال 1997 در ویروس H5N1 جدا شده از انسان و مرغ مشاهده شده بودند .
اگر چه این گونه انتقال های بین گونه ای غیر معمول می باشد اما كاملاُ مشخص شده كه برای شناسایی زود بهنگام میكروارگانیسم مسئول بیماری ضروری می باشد . تشخیص سریع و تعیین خصوصیت ویروسهای آنفولانزا برای مقایسه واریانتهای جدید با سویه هایی كه اخیراُ در چرخش می باشند و نیز با سویه های واكسن ضروری می باشد .
برای این هدف ، ویروسهای آنفولانزایی كه در آزمایشگاههای تشخیصی جدا
می شوند بطور روتین برای بررسی ژنتیكی و آنتی ژنیكی به آزمایشگاه رفرنس فرستاده می شوند .
گلیكوپروتئین هماگلوتینین ویروس آنفولانزا بعنوان یك پیش ساز تولید می شود (HAO) كه نیاز به شكستن بعد از ترجمه توسط پروته آزهای میزبان جهت فعال شدنش دارد . پروتئین های HAO پیش ساز دسته كم پاتوژن آنفولانزای مرغی دارای یك اسید آمینه آرژنین در محل برش می باشند و فقط توسط پروته آزهای میزبان مانند آنزیم شبه تریپسین محدود می شوند بنابراین به همانند سازی در محل هایی از بدن كه این آنزیمها یافت می شوند محدود میگردد ، مثل دستگاه تنفسی و روده ای . ویروسهای HPAI دارای اساس چند آمینواسیدی (آرژنین و لیزین ) در محلهای برش HAO هستند و بوسیله آنزیم منحصر بفرد پروته آزی این ویروسها قادر هستند در میان پرندگان همانند سازی كنند به ارگانهای حیاتی و بافتها آسیب برسانند كه منجر به بیماری و مرگ می شوند .

مشخصات آنفولانزای مرغی در پرندگان :

بطور عمده پرندگان آبزی بعنوان میزبانهای اصلی این ویروسها را در روده و ترشحات آن دارا می باشند . طیور آلوده ویروس را از طریق بزاق ، ترشحات بینی و مدفوعشان دفع ژمی كنند . آنفولانزای مرغی در میان پرندگان مستعد هنگامی كه آنها با ترشحات پرندگان آلوده تماس پیدا می كنند منتشر می شود اما در هر حال انتقال دهانی ـ مدفوعی شایع ترین مدل انتشار می باشد .
بیشتر ویروسهای آنفولانزا باعث بروز علائمی در پرندگان وحشی نمی شود یا اینكه فقط علائم خفیفی ایجاد می كنند . البته میزان بروز علائم درانواع پرندگان بسیار متفاوت می باشد وبستگی به سویه ویروس و نوع پرنده دارد. عفونت با ویروسهای اصلی آنفولانزای A ( برای مثال تعدادی از سویه های H5 وH7 ) می تواند باعث شیوع گسترده بیماری ومرگ ومیر در میان تعدادی از پرندگان وحشی و بخصوص پرندگان اهلی مانند جوجه ها و بوقلمون می شود.

علائم آنفولانزای مرغی در انسان :

علائم گزارش شده دارای طیفی از علائم آنفولانزای تیپیك (برای مثال تب ، سرفه ، گلودرد ودرد ماهیچه ) تا علائم چشمی ، پنومونیا ، اختلالات حاد تنفسی ، پنومونیا ویروسی ، و دیگر عوارض تهدید كننده سلامت می باشد .

انتقال :

پرنده آلوده ویروس را در مدفوع و ترشحات مجرای بینی دفع می كند . تصور می شود كه گله های بهبود یافته نیز ویروس را البته به میزان كمتری نسبت به گله های با بیماری حاد دفع كنند .
مرغ های وحشی واهلی جزء اولین مخازن ویروسهای آنفولانزا هستند . مرغابی وحشی معمولاُ علائم كلینیكی را نشان نمی دهد ولی می تواند برای مدت طولانی ویروس را حمل كند . بعلاوه ، مرغابی می تواند با بیش ازیك نوع ویروس عفونی گردد . تعیین تایپها با این مشكل همراه است كه آنتی بادی قابل جداسازی در خون این پرندگان بعد از در معرض قرار گرفتن یافت نمی گردد . ویروس آنفولانزای موجود در آب و مواد معدنی ,آلی ، دریاچه ها و استخرها توسط مرغابی های عفونی دوباره وارد چرخه می شود . مخلوط شدن این پرندگان با مرغابی های پرورشی یكی از فاكتورهای دخیل در بروز تعدادی از همه گیری ها می باشد .
ویروس آنفولانزای مرغی می تواند برای مدتهای طولانی در دماهای معتدل زنده باقی بماند. ودر موارد فریز شده نیز برای مدت نامحدود زنده باقی می ماند .
بنابراین بیماری می تواند از طریق دفع غلط اجساد وكود ویا دیگر محصولات طیور منتشر گردد .
همچنین این بیماری می تواند براحتی توسط مردم و وسایل آلوده به ویروس آنفولانزا منتشر گردد . این ویروس می تواند برروی كفش های آلوده ، لباسها ، صندوق ، كارتن های تخم مرغ ، حاملین ودیگر تجهیزات انتقال پیدا كند.تمام محل های مزرعه طیور آلوده بایستی مورد توجه قرار گیرند وبطور كامل تمیز وضد عفونی شوند ، قبل از اینكه مجوز انتقال به آنها داده شود لباسهایی كه در مزرعه آلوده پوشیده شده باید حتماُ شسته شوند .
حشرات وجوندگان ممكن است بطور مكانیكی ویروس را از پرندگان آلوده به پرندگان مستعد حمل كنند . ویروس آنفولانزای مرغی از تخم های اردك جدا شده است و این مسئله احتمال انتقال عمودی یا vertical را مطرح می سازد اگرچه بطورتیپیك ویروس جنین تخم مرغ رامی کشد . شواهد كم و ناچیزی ازعفونت جوجه با منشأتخم در دست می باشد . ولی سطح پوسته تخم مرغها می تواند با ویروس آلوده شود در نتیجه یك راه انتقال محسوب می شود .
ویروس آنفولانزای مرغی بكرات از پرندگان وارداتی سالم جداشده است . این پرندگان آلوده یك خطر بالقوه برای پرندگان قفسی ، وحشی و گله های طیور پرورشی محسوب می شوند . مغازه های فروش پرندگان زنده یك مخزن عفونت می باشند . این مغازه ها اغلب انواع پرندگان خانگی و زینتی را می فروشند و به ندرت این محل ها تمیز یا ضد عفونی می شوند .
این سیستم كه انواع مختلف طیور استرس دیده را با هم مخلوط می سازد یك عامل كلیدی در شیوع آنفولانزا در تجارت طیور می باشد .
صاحبان مرغداریها خود اولین خط دفاعی برای شناسایی شیوع آنفولانزای مرغی هستند . اگر پرندگان در نشان دادن علائم آنفولانزای مرغی پیشرفت كردند بایستی بلافاصله به سازمانهای مسئول اطلاع دهند .

پیشگیری :

برنامه واكسیناسیون ، مراقبت سخت در طول مدت دوره چهل روزه پرورش طیور برای كنترل فرمهای خفیف بیماری در گله های مرغی و اردكها مورد استفاده قرار می گیرد . اما در مورد بیماری های كشنده تر مراقبت سخت درطول دوره وجداسازی جوجه های آلوده تنها روش مؤثر در متوقف كردن آنفولانزای مرغی می باشد.
موفقیت در چنین برنامه هایی بستگی به همكاری كامل و حمایت دولت از صنعت طیور دارد .
با شناخت این مسئله كه مخزن آنفولانزای مرغی مرغابی های وحشی می باشند هر كوششی باید بر اساس جلوگیری از تماس مستقیم و غیرمستقیم بین پرندگان خانگی و مرغابی های وحشی طرح ریزی گردد .(2)
WHO (سازمان بهداشت جهانی) و مدیریت عفونتهای انسانی از طریق كنترل آنفولانزای A(H5N1) این راهنمایی ها بر اساس اطلاعات موجود از عفونتهای آنفولانزای انسانی A (H5N1) كه از تجربیات بدست آمده از شیوع 1997 در هنگ كنگ یك منطقه اختصاصی اداری از چین و از گزارشات اولیه از موارد اخیر در تایلند و ویتنام استخراج شده است . همانطور كه اطلاعات بیشتر بدست می آید این راهنمایی ها نیز بطور مناسب تغییر پیدا می كند .(2)

توجه :

مفهوم اولیه كنترل عفونت رعایت احتیاط برای به حداقل رساندن انتشار تنفسی بیماری می باشد .
مدیریت مناسب برای پیشگیری از بیماری حاد ومرگ ومیر شناسایی زود هنگام و دنبال كردن افرادی كه در رسیك ابتلاء هستند . به منظور درمان آنها با داروهای ضد ویروسی برای كاهش میزان مرگ ومیرو انتشار بعدی بیماری .

هشدارهای عمومی :

كنترل عفونت موجود شامل به كار بردن احتیاط های استاندارد برای تمام بیمارانی كه به بیمارستان مراجعه می كنند می باشد .
اگر كه تشخیص آنفولانزای A (H5N1) بر اساس علائم بالینی داده شود بایستی احتیاطهای اضافی تا موقعی كه تشخیص رد شود رعایت گردد .
در آن كشور ها وسرزمین هایی كه ویروس های آنفولانزای A(H5N1) بعنوان یك عامل بیماری زائی در جمعیت های حیوانی شناسایی شده است ، تشخیص آنفولانزای H5N1 بایستی با دیگر بیماریهای حاد تنفسی تمایز داده شود . اشخاصی كه هم با طیور بیمار وهم با طیوری كه از بیماری تلف شده اند در تماس هستند در معرض ریسك ابتلای بیشتری هستند .
كشور ها یا سرزمین هایی كه بطور تجربی با شیوع آنفولانزای مرغی با بیماریزایی بالا مواجه هستند بایستی افرادی كه در بخش بهداشت و پزشكی كار می كنند با واكسن فصلی نو تركیب سازمان بهداشت جهانی واكسینه شوند . بطور منطقی این موضوع سبب كاهش فرصت ایجاد عفونت در انسانها توسط ویروس آنفولانزای مرغی می شود ولی درعوض،فرصتی را برای بازآرائی وظهورآنفولانزای جدید با قدرت جهانی شدن پدید
می آورد.
-كنترل عفونت و پیشگیری از انتشار تنفسی آنفولانزای :A (H5N1)
انتقال آنفولانزای انسانی بوسیله قطرات و ذرات منتشر در هوا صورت می گیرد . انتقال توسط تماس مستقیم و غیر مستقیم نیز شناسایی گردیده است . لیكن در طول سال 1997 آنفولانزای A (H5N1) در انسانهادر SAR هنگ كنگ ، رعایت احتیاط های مربوط به انتشار قطرات و تماس مستقیم بطور موفقیت آمیز از انتشار بیماری جلوگیری كرد .
بدلیل درصد بالای مرگ ومیر بیماری و احتمال موتاسیون ویروس كه باعث انتقال فرد به فرد شود سازمان بهداشت جهانی استفاده از ماسكهای بسیار مؤثر به منظور رعایت احتیاط هنگام تماس و برخورد با قطرات معلق توصیه كرد . بعلاوه اگر كه یك اطاق با فشار منفی در دسترس باشد بهتر می باشد .
ایزوله كردن بیمار در یك اتاق ، اگر كه یك اتاق جداگانه در دسترس نباشد بیماران بایستی به طور جداگانه در یك بخش یا اتاق مجزا بستری شوند . تختها بایستی یك متر با هم فاصله داشته باشد و بهتر است كه تختها بوسیله یك سد فیزیكی مثل پارتیشن از هم مجزا گردند .
مناسبترین روش برای محافظت اشخاصی كه وارد اتاق می شوند استفاده ازگان ، ماسكهای بسیار قوی ، محافظ صورت یا عینك و دستكش می باشد . تعدادمحدودی از كاركنان سازمان بهداشت جهانی (HCW) كه دارای تماس مستقیم با بیماران بودند نبایستی با بیماران دیگر برخورد كنند .
تعداد دیگری از كارمندان بیمارستان (مانند نظافت چی ها و پرسنل آزمایشگاه) كه با محیط این بیماران در تماس هستند همچنین بایستی محدود گردند .
بایستی از HCW ها (پرسنل بیمارستان ) كه در تماس با بیماران هستند خواسته شود كه روزانه دوبار دمای بدنشان راچك كنند وهرگونه تبی را به مسئولین بیمارستان گزارش دهند . یك HCW كه دارای تب بالای 37c است و در تماس مستقیم با بیماران بوده است بلافاصله بایستی درمان شود .
راهكارهای پیشگیرانه بعد از در معرض قرار گرفتن (برای مثال: داروهای خوراكی oseltamivir به میزان روزانه 7mg برای 7روز) برای پرسنل بیمارستانی كه احتمال تماس با ترشحات افراد بیمار برایشان وجود دارد توصیه می شود HCW هایی كه حال عمومی خوبی ندارند نبایستی با بیماران در تماس مستقیم باشند چرا كه آنها آسیب پذیر هستند و ممكن است كه وقتی كه در معرض ویروس H5N1 قرار گیرند بیماری حاد تری را روی كاربیاورند .

مدیریت بیماران :

گرفتن نمونه خون ودستگاه تنفس و ارسال به آزمایشگاه برای تست آنفولانزا و دیگر عفونتهایی كه علائم بالینی مشترك دارند .
درمان با اینهیبیتور نورآمینیدازها مانند oseltamivir (بصورت 75mg خوراكی ، دوبار در روز) بعنوان اولین مراحل درمان بكار میرود .
اگر كه علائم بالینی ظاهرشد بیمار بایستی در بخشی كه قبلاُ توضیح داده شد برای كنترل عفونت بستری گردد.
اگر كه تشخیص داده شد بیمار نیاز به بستری شدن ندارد بایستی به بیمار وخانواده اش ضوابط بهداشت فردی و كنترل عفونت (برای مثال: شستن دستها، استفاده از ماسك كاغذی یا جراحی برای شخص بیمار وپرهیز از تماس جمعی) آموزش داده شود اگر كه نیاز دارد توسط دارو تحت درمان حمایتی قرار گیرد همچنین بیمار با پزشك معالج توسط تلفن ویا ویزیت شدن در تماس باشد .درمانهای حمایتی شامل مراقبت از اشباع بودن اكسیژن واستفاده از ذخیره اكسیژن در صورت كم شدن اكسیژن ماسكهای اكسیژن nebulizer ویا high-air-flowدر سندرم عفونت حاد تنفسی برای پیشگیری از انتشار تنفسی بكار می رود .
این توصیه ها فقط هنگامی كه بیماری شدید باشد و كنترل آن مشكل می باشد مورد نیاز هستند .
گرفتن نمونه های خون وتنفسی بطور مرتب برای چك كردن عفونتهای باكتریایی احتمالی مورد نیاز می باشد . استفاده از درمان آنتی بیوتیكی به صورت تزریقی را نیز باید در نظر داشت . از آمانتیدین یا ریمانتیدین استفاده نكنید بدلیل خطر افزایش موتاسیون انتخابی در جهت مقاومت ویروسی با توانایی جهانی شدن . نتایج اولیه كه توسط مراكز مختلف بهداشت جهانی بدست آمده پیشنهاد می كند كه ویروس آنفولانزای A (H5N1) كه اخیراُ از انسانها جدا شده اند نسبت به آمانتیدین وریمانتیدین مقاوم می باشند .
پرهیز از تجویز سالیسیلاتها (مانند آسپیرین) در بچه های زیر 18سال بدلیل ریسك سندرم reye .
استفاده از paracetamol یا ibuprofen با هم بصورت خوراكی یا شیافت برای كنترل تب.
تعدیل كنندهای سیستم ایمنی مانند كورتیكواستروئیدها بایستی فقط به موازات عملیات كلینیكی صورت گیرد. پاسخ ایمنی انسان در مقابل آنفولانزای A (H5N1) هنوز نیاز به مطالعات بیشتری دارد .
از ribavirin استفاده نكنید. هیچگونه شواهدی دال بر مؤثر بودن این دارو بر علیه آنفولانزا وجود ندارد در عوض عوارض ناخواسته مانند آنمی شایع می باشد و ممكن است كه بیمار را بیشتر به مخاطره بیاندازد .
برای فهم بهتر الگوی دفع ویروس در انسانهای عفونی شده با ویروسها A (H5N1) در شیوع آنفولانزا در تایلند وویتنام نیاز به مطالعات بیشتری می باشد . تا اینكه شواهد دیگری به دست آید در حال حاضر WHO توصیه كرده است كه ضوابط كنترل عفونت تا 7روز بعد از قطع تب ادامه پیدا كند .
مطالعات قبلی برروی آنفولانزا براین امر كه كودكان باسن كمتراز 12سال می توانند برای 21روز پس از شروع بیماری ویروس را دفع كنند می باشد . بنابراین ، برای كنترل عفونت بهتر است كه كودكان برای این دوره در محل مراقبت باقی بمانند . كودكان در این مدت نبایستی به مدرسه بروند .
افرادی كه بااین بیماران در تماس مستقیم بوده اند بلیستی برای 7روز تحت نظر قرار گرفته شوند ودمای بدن آنها دوبار در روز چك شود اگر كه فردی تب بالاتر از 38c و سرفه یا تنگی نفس را نشان داد بایستی بلافاصله درمان شود .
آنفولانزای مرغی جدید در دانمارك،10000 اردك را ازبین برد .
ویروس A H5N1 در اردكها شناسایی شد .
یك نوع جدید ویروس A آنفولانزا ،H5N1 ، برای اولین بار در اردكهای دانماركی شناسایی شد . بدنبال ظهور بیماری بین 12000 اردك . در یك مزرعه اردك نزدیك به شهر salling در jutland دو ویروس شناسایی شدند: یك ویروس عامل Entritis در اردك (DVE) ،كه عامل بیماری بود ویك ویروس آنفولانزای A .
تمامی اردكها بطور خیلی وسیعی در 10 سپتامبر 2003 درگیر بیماری شدند . ویروس آنفولانزایA از بافت تعدادی از اردكها جدا شد . انستیوسرم سازی statens از RT – PCRطول كامل هماگلوتینین ونورآمینیداز با تعیین توالی روتین كه ترجیحاُ بطور مستقیم برروی نمونه ها انجام می گیرد تا برروی ویروسهای كشت داده شده استفاده كردند و ژنوتیپ این ویروس را H5N7 نام نهادند .
این تایپ قبلاُ هیچ گاه شناسایی نشده بود وبررسی های بیشتر هم اكنون برروی آن در حال انجام است . نكته با اهمیت اینكه این ویروس در انسانها تشخیص داده نشده بخصوص در میان افرادی كه با این اردكها تماس داشتند یا در تعدادی موارد غیر مرتبط ویروس آنفولانزای (H3N2) A در دانمارك از 1 سپتامبر 2003 تشخیص داده شد .12 سویه ویروس آنفولانزای مرغی (AIV) A از پرندگان وحشی در دانمارك از 1996 جدا شد كه هیچ كدام از آنها H5 یا H7 نبود .
پرندگان وحشی مخزن طبیعی آنفولانزای مرغی هستند (AIV) . اگر چه ویروسهای كم پاتوژن H5 وH7 وجود دارد ولی تمامی ویروسها با بیماری زایی بالا یا H5 یا H7 هستند . پاتوژنسیته ویروسهای AIV H7 و H5 حداقل تا قسمتی وابسته به توالی آمینو اسیدی در محل برش در HA1/HA2 دارد. چنین توالی های پاتوژنیكی یافت نشدند . بنابراین این سویه AIV در گروه ویروسهای باپاتوژنسیته پائین قرار گرفت . توانایی تغییر پاتوژنسیته مثلاُ طی تكثیر در پرندگان یا نوتركیبی در خوكها ویا انسانها شناسایی نشده است . ویروسهای بسیار پاتوژن AIV از تیپ H5 و N7 اغلب انسانها را درگیر می سازند .این مسئله در سال 1997 در هنگ كنگ رخ داد (H5N1) كه 6 نفر از 18 فرد آلوده شده از بین رفتند ودوباره در سال 2003 كه یكی از دو فرد آلوده شده مردند ودر سال 2003 در Netherland سویه H7N7 شایع شد كه 1 نفر از هر 80 بیمار از بین رفتند . سازمان بهداشت جهانی تصویب كرد تمامی كشورها كمیته های بین المللی در مورد مدیریت اپیدمی های آنفولانزا تشكیل گردد .
شبكه های آزمایشگاهی نظارتی و روشهای ژنوتایپ كردن بایستی با كارهای این كمیته های بین المللی هماهنگ شود .
ویروسهای آنفولانزای مرغی عوامل مشترك بین انسان وحیوان می باشند كه بعنوان یك خطر مداوم سلامت جمعیت های انسانی وحیوانی را تهدید می كند . طی 6 سال گذشته، عفونت انسانها با ویروسهای آنفولانزای مرغی از 3 تحت تیپ (H5, H7, H9) بكرات تشخیص داده شده است .
ویروس آنفولانزای مرغی H7N7 كه سبب آنفولانزای شدید در 225 مزرعه طیور در هلند در سال 2003 شد همراه با عفونت ملتحمه چشم (conjunctivitis) در 347 انسان بود . عفونت با ویروس H7N7 در 87 مورد، مورد تأئید قرار گرفت ، یك نفر دامپزشك در اثر عفونت جان سپرد . شواهدی از انتقال فرد به فرد ویروس و ایجاد عفونت درخوكها دردست می باشد . این شیوع بوسیله جداكردن وقرنطینه كردن طیور عفونی كنترل شد . برای جلوگیری از پدید آمدن وانتشار ویروس نوترتیب مرغی ـ انسانی كارگران مرغداریها بوسیله واكسن آنفولانزای انسانی واكسینه شدند وداروی آنتی نورآمینیداز به آنها داده شد .
انتقال آنفولانزای مرغی H5N1 به انسانها در سال 1997 ثابت كرد كه این ویروس علی رغم اینكه ترجیح می دهدبارسپتورهای سیالیك اسیدمرغی باند شوند توانایی انتقال به انسان رادارد (برای مثال آنهابایك gal 3 و2 × انتهایی لینك می شوند .)
قبل از 1997، گزارشاتی از عفونتهای انسانی باH7N7 وجود داشت (معمولاُ باعث عفونت ملتحمه می شد) ، اما شواهد محكمی دال بر انتقال مكرر ویروسهای مرغی به انسانها دردست نبود . چگونه ویروسهای آنفولانزای مرغی در ایجاد عفونت در پستانداران به طور تصاعدی قوی تر شده اند؟
ارزیابی تلفیق PCR با MOBILITY هترودوبلكس برای تعیین و تشخیص ویروسهای آنفولانزای A از انواع حیوانات :

خلاصه :

انتقال ویروسهای آنفولانزای A از حیوانات میزبان به انسان ممكن است به پدید آمدن گونه های جدید با همه گیری جهانی شود . تشخیص زود بهنگام چنین وقایعی در ابقاء ویروسهای آنفولانزا در درحه اول اهمیت قرار دارد . برای تشخیص و تعیین خصوصیت نسبی ویروسهای آنفولانزای A از گونه های مختلف حیوانات روش توأم RT-PCR و (HMA) heteroduplex mobility طراحی گردید. نشان داده شد كه این تغییر پذیری (m) ژن در RT-PCR می تواند حساس شود و برای تعیین ویروسهای آنفولانزای A انسانی و مرغی وخوكی اختصاصی گردد.
قطعات تكثیر شده توسط PCR از ویروسهای انسان ، طیور وخوك از 15 تحت تیپ مختلف،با بین 9/1 و4/21 اختلاف نوكلئوتیدی بوسیله روش HMA تمایز گذاشته شد .
تعیین توالی ampliconها نشان داد كه الگوی تغییر پذیری هترودوبلكس بااختلاف توالی ها بین DNA مورد آزمایش ورفرنس مرتبط می باشد . متد تكثیرRT-PCR HMA برای جستجوی سریع نمونه ها با یك پانل رفرنس از منشأ ویروسهای انسانی ومرغی وخوكی تشخیص داده شد .
ویروسهای مرغی (A / Hongkong / 1073 / 99) H9N2 كه با گونه های انسانی واكنش متقاطع داشتند در مقابل panel رفرنس مورد بررسی قرارگرفتند . مشخص شد كه محصولات PCRاین سویه بیشترین شباهت را با سویه (A / Quil /Hongkong / GI / 97 ) H9N2 دارد. بررسی توالی ها نشان داد یك اختلاف 101% نوكلئوتیدیبین قطعات amplicon مربوط به A / Quil /Hongkong / GI / 97 و A / Hongkong / 1073 / 99 وجود دارد . با توجه به نتایج كار ما ، روش RT-PCR HMA یك راه سریع و حساس برای جستجوی ویروسهای آنفولانزای جدیدوغیرمعمول می باشد.شناسایی ویروسهای آنفولانزا معمولاُ شامل رشد ویروس در كشت بافت یا جنین تخم مرغ ، قبل از بررسی تایپها یا ساب تایپها بوسیله ممانعت از هماگلوتیناسیون (HI) می باشد .
لیكن ، این كارها وقت می برد وشناسایی گونه های منشأ ویروس ضروری نمی باشد . به همین دلیل ماروش (RT) – PCR براساس ژن ماتریكس (M) توأم با روش هترودوبلكس (HMA) mobility برروی محصولات PCR پایه گذاری كردیم .
پروسه خالص سازی نوكلئیك اسیدهای ویروس باشناسایی توسطHMA24 تا36 ساعت وقت می برد و می توان بطور مستقیم آن را برروی نمونه های كلینیكی انجام شود . روش RT-PCR HMA كه در اینجا شرح داده می شود به تشخیص زود به هنگام انتقال داخل گونه ای بین میزبانهای انسانی وحیوانی كمك خواهد كرد .

مواد و روشها :

جداسازی ویروس :

ویروسهای آنفولانزا درحفره های آلانتوئیك جنین تخم مرغ رشد می كند . مایع حاوی مایع آلانتوئیك جداسازی شده ودردمای 70c تا موقع مورد نیاز نگهداری می شود .ویروسهایی كه در این مطالعه استفاده شده اند .
ویروسهای /Taiwan/7310/10 ، A/SW/oms/2899/82 ، A/SW/oms/3633/84، /SW/Scotland/410440/94 ، A/SW/hongkong/168/93 ،A/HK/1774/99 و A/HK/1073/99 بوسیله yipu lin و alan hay مؤسسه بین المللی تحقیقات پزشكی در mill hill انگلستان فراهم شد .
جدا سازی A/DUCK/singapor q/f 119-3/97 بوسیله آزمایشگاه دامپزشكی منشعب از مركز دامپزشكی سنگاپور انجام گرفت .
ویروس تایپنگ : ویروسهای آنفولانزا كه تایپ می شوند با استفاده از آنتی سرم موش خرما همانطوری كه قبلاُ شرح داده شد انجام می شد . تمام تستهای HI با استفاده از HAU 8 از ویروسها و 5% سلولهای قرمز (vol/vol) turkey انجام گرفت .
سنتز cDNA وخالص سازی نوكلئیك اسید :
RNA ویروسی از یك میزان 150mg از نمونه بوسیله روش باند شدن با گوآنیدینوم تیوسیانات باسیلیكا همانطوری كه قبلاُشرح داده شد انجام گرفت . rna ویروسی در 30 از نوكئازها وآب آزاد حل می شود .
RT از RNA به CDNA بوسیله اضافه كردن 2/22 از RNA به 8/17 مخلوط RT حاوی 20Mm Tris-Hcl (PH=8/4) ، 50 Mm ، KCL و 7/5 Mm ، mgcl2 و 3Mm از هر داكسی نوكلئوتید تری فسفات و 25ng از پرایمرهای راندم (pdn6) و 1/6 u از rnasine و2007 از revers transcriptase ویروس لوسمی موشی (moloney) انجام
می شود .
این مخلوط در دمای 20c برای 10 دقیقه انكوبیت می شود وسپس در 37c برای 45 دقیقه نگهداری می گردد . سپس نمونه ها برای 65 دقیقه تا 100c حرارت می بینند وبعد روی یخ گذاشته می شوند .
مواد اصلی PCR : توالی های پرایمر بدنبال بررسی نواحی حفاظت شده از ژن m مربوط به ویروسهای آنفولانزای A بدست آمدند.خصوصیات پرایمرها بانرم افزار oligo primer analysis بررسی می شوند .جفت پرایمری كه در مایه RT- PCR مربوط به m gene مورد استفاده قرار می گیرددر جدول شماره 2 آمده است.
پرامر خارجی ،amp71f قبلاُ برای استفاده در یك مایه pcr برای تعیین ویروسهای آنفولانزای انسانی طراحی شده است . هر جفت پرایمر در مجاورت مقدار مشخصی از mgcl2 ، نمك و PH انجام می گیرد. برای PCR اولیه، 20 L از cdna به 80 L مخلوط PCR حاوی 8 L از بافر 10XPCR ((PH : 8/4) tris- hcl , 200Mm و kcl 500ml ) و2/4 l از mgcl2 50mm و 1 l ازهرپرایمر خارجی در l (amp 71f ,amp831r ) 5 pmol/
و 6/7/3 l از نوكلئاز – آب آزاد و /3 l از DNA, taq پلی مراز استفاده می شود .
دمای اپیتیم برای چسبیدن برای جفت پرایمروحالت چرخشی بااستفاده از یك mastercycler Gradient thermalcyler تعیین می گردد . تكثیر اولیه بوسیله 1 سیكل در دمای 94c برای 2 دقیقه انجام می شود وبعد با 30 سیكل دناتوره كردن در دمای 94cبرای یك دقیقه دنبال می شود وتواماُ چسبیدن وطولانی شدن در دمای 68c برای 1/5 دقیقه انجام می شود . محصولات اولیه تكثیر یافته از ویروس های رشد كرده برروی تخم مرغ به نسبت 1 در 10000 قبل از تكثیر ثانویه رقیق می كردند . یك مقدار از محصول اولیه (2 l) سپس به 48 l از مخلوط ثانویه pcr حاوی 5 lاز10 xpcr buffr (ph:8/4)tris-hcl ,200mm) و (kcl 500mm و 1 l از مخلوط داكسی نوكلئوزید تری فسفات و 1/5 l از 3 l , 50mm mgcl2 ازهر پرایمر داخلی در 25 pmol/ l (amp227f , amp 622r) و 34/2 l از نوكلئاز-آب آزاد و /3 l از DNA, taq پلی مراز اضافه می كنیم . نمونه ها در دمای 94c برای 1 دقیقه انكوبیت می شوند وسپس برای 32 سیكل در معرض 94c به مدت 1 دقیقه و60c برای یك دقیقه و72c برای یك دقیقه قرار می گیرند .
Amplicon های (413bp) بوسیله رنگ آمیزی با اتیدیوم بروماید قابل رؤیت می شود و متعاقبأ برروی ژل آگارز2% الكتروفور می شود . -تعیین حساسیت روش (I RT-PCR) تیتراسیون عفونت زایی ویروس :
روش های عفونت زایی همانطور كه قبلاُشرح داده شدبا تغییرات كوچكی انجام می گیرد . تعداد10رقت (10 -10)
از ویروسهای syd/97(h3n2) و DK/sing/97(h5n3) و HK/1073/99(h,n2) در محیط ترانسپورت ویروسی تهیه گردید . (vtm) ذمان انكوباسیون به 72 ساعت دریك انكوباتور co2 در 37c تغییر پیدا می كند . سلولهای كلیه سگ madin-darby بوسیله گلوتارآلدئید5% فیكس گردیدند وپلاكه بوسیله رنگ آمیزی با محلول كربول فوشین 5% vol/vol قابل رؤیت شدند .
RT-PCR(ii) : مقداری ازمحلول تازه وزنده ازهرویروس(100 l) حل شده در vtm در مجاورت عصاره نوكلئیك اسید و RT-PCR همانطوركه قبلاُشرح داده شد قرارداده می شود .

روش Heterduplex :

متدهای آنالیز hma كه قبلاُ شرح داده شد برای مطالعه گونه های مشابه ویروس نقص ایمنی انسان تیپ 1 آداپته شدند . برای hma ، 3 l از نمونه محصول pcr با 3 l ازمحصول pcrرفرنس و /3 l از بافر hmaحاوی1 m nacl و 100mm tris (ph:7/8)و 20mm edta مخلوط می گردد.
نمونه ها سپس در دمای 95cبرای 2 دقیقه دناتوره می شوند وسریعاُ تا دمای4c سرد می شوند . سپس برای 10 دقیقه برروی یخ گذارده می شوند .سپس بافر(1/3 l) gel loading اضافه می شود .
برم فنل بلو1% و glycerol و(g x ; tris-boric acid-edta{tbe} , 1% xylen cynol) نمونه ها برروی ژلهای پلی ساكاریدی غیر دناتوره 8% در(nove x TBE ) 1 x TBE برای 50 دقیقه در ولتاژ 200V الكتروفورز می شوند.همودوبلكس ها وهترودوبلكس ها بدنبال رنگ آمیزی ژل با sybr greenII قابل رؤیت می شوند.
تعیین توالی وبررسی فیلوژنیك : تعیین توالی نوكلئوتیدی amplicon های pcr m ژن بااستفاده از روش dye deoxy terminator انجام گرفت .
محصولات PCR m ژن بااستفاده از جفت پرایمر داخلی PCR amp227f و amp622r در 3/2 pmol/reaction تعیین توالی شدند. بررسی فیلوژنیك خوشاندی به دنبال تعیین توالی با استفاده از برنامه magaling4 انجام گرفت .

نتایج :

-تعیین میزان حساسیت و اختصاصی بودن RT-PCRبرای m ژن: حساسیت تشخیص ویروس آنفولانزایA بوسیله روش RT-PCR برای Mژن با استفاده از سه ساب تیپ ویروس آنفولانزایA به نامهایsyd/97(h3n2) و dk/sing/97(h5n3) و Hk/1073/99(h9n2) انجام گرفت . رقتهای سریال و متوالی از عصاره ویروسی تازه این ویروسها در vtm تهیه گردید. ازهررقتی، نوكلئتیك اسیدها برای سنتز cDNA و PCR جمع آوری شدند. به همین میزان نیز به ارزیابی عفونت زایی این روش ازهررقتی گرفته شد كه همان روز انجام گرفت در این الگو ، رقت نقطه پایان برای عفونت زایی ویروس می توانست مستقیماُ با نقطه پایان تشخیص RNA ویروسی بوسیله RT-PCR مقایسه گردد.
M ژن كه برای RT-PCR به كارمی رود 10pfu از ویروسهای آنفولانزایA (H9N2 , H5N3 , H3N2) درمیلی لیتر می باشد .این با حساسیت گزارش شده برای تشخیص ویروسهای آنفولانزایA وB بوسیله روش NESTED RT-PCR بااستفاده از پرایمرهای اختصاصی برای ژنهای HAاز ویروسهای آنفولانزایA وB می باشد.RT-PCR برای میزان توانائیش در تشخیص ویروسهای آنفولانزایA از انواع حیوانات ومیزای اختصاصی بودنش برای ویروسهای آنفولانزایA مورد آزمایش قرار گرفت .
یك محصولی با اندازه ای كه انتظار می رفت (413bp) هنگامی كه ویروسهای آنفولانزای A مرغی ، انسانی یا خوكی آزمایش شدند بدست آمد . این نتایج نشان می دهد كه توالی های mژن ویروسهای آنفولانزای A تمام حیوانات آزمایش شده را می توان با پرایمرهای لیست شده در جدول 2 تكثیر كرد .یكسری محصولات نامعلوم PCR هنگامی كه ویروسهای آنفولانزایB تست شدند مشاهده شدند ، كه دلالت بر اختصاصی بودن PCR برای توالی های ویروسهای آنفولانزای A می كند .
تعیین مشخصات آمپلیكونهای Mژن بوسیله HMA وتأئید توالی های آن :
بعد از تكثیر Mژن بوسیله RT-PCR اختصاصی بودن محصول PCR برای هرویروس بامنشأ میزبانی خاص بوسیله HMA مورد تحقیق وتخصص قرارگرفت . این كار با استفاده از بررسی طریقه فرم گرفتن هترودوبلكس بین آمپلیكونهای یك ویروس آنفولانزایA انسانی رفرنس (bay/95) وآمپلیكونهای ویروسهای مورد آزمایش از 15 ویروس آنفولانزای A مختلف از ساب تایپهای انسانی و خوكی ومرغی صورت گرفت . (جدول شماره یك ) (نتایج در شكل 2 نشان داده شده اند)
هترودوبلكس هایی كه بین آمپلیكونهای سویه رفرنس (BAY/95) ومحصول PCR هر ویروس مورد آزمایش مشاهده می شوند ، منعكس كنند تغییر توالی بین ویروس رفرنس وDNA ویروس مورد آزمایش می باشد .
هیچ هترودوبلكسی در ستونی كه حاوی فقط محصول PCR رفرنس می باشد مشاهده نمی شود .(lane 1,17) .كمترین كاهش در تغییر هترودوبلكس درجایی مشاهده می شود كه محصول ویروس رفرنس (bay/95) با آمپلیكون ویروس wuh/371/95 مخلوط گردیده است (lane 2) . هر دو ویروس bay/7/95 و wuh/371/95 از سویه های ویروس آنفولانزای انسانیA ،H1N1 می باشند .
بررسی توالی ها بر این امر دلالت می كند كه آمپلیكونهای Mژن ویروسbay/95 و wuh/371/95 تا 9/1% اختلاف دارند .
بنابراین آمپلیكونهای با بیشتر از 2% variation درتوالی نوكلئوتیدی بوسیله این روش HMA می تواند متمایز گردد .
هیچ اصلاحی در دوباره حل شدن باند وقتی كه 10% ، 20% ، یا گرادیان ژلهای پلی آكریل آمید استفاده شد مشاهده نشد . بیشترین میزان كم شدن در تغیرپذیری در ستونی مه آمپلیكون رفرنس از bay/95 با محصولات pcr ویروسهایی كه دارای mژنهای ویروسی خوكی یا مرغی مخلوط شده اند مشاهده می گردد .(ستون 3 و4 و7 تا 16). اختلافات نوكلئوتیدی بین آمپلیكونهای pcr از این ویروسهای مرغی وخوكی وویروس رفرنس انسانی سویه bay/95 بوسیله بررسی توالی بین 5/14% و 4/21% مشاهده شد . (جدول 3) میزان متوسط الگوی تغییر هترودوبلكس در مخلوطهای حاوی آمپلیكونهای pcrاز ویروسهای انسانی (bay/95) H1N1 وویروسهای انسانی H3N2 تست و syd/97 و wuh/359/95 مشاهده شد (بترتیب ستون 5 و6) بررسی توالی ها یك اختلاف نوكلئوتیدی 7/6 تا 9/7 درصدی را بین ویروس H1N1 انسانی و آمپلیكونهای mژن ویروس انسانی H3N2 تست مشاهده شد .
ارزیابی یك الگوی رفرنسHMA برای تعیین انتقال بین گونه ها :
یك پانل از 9 و یروس آنفولانزای A با ژنهاب M كه در دودمان انسانی ، خوكی وطیور وجود دارند ساخته شد .
RNA از اینها و یك ویروس تست خالص سازی می شود (HK/1073/99) و RT-PCR روی آن انجام می گیرد .
آمپلیكونهای با اندازه ای كه اتنظار می رفت (314bp) بوسیله ژل آگاروز الكتروفورز قابل رؤیت می شود  یك قسمتی از هر آمپلیكون رفرنس برای hma با محصول pcr ویروس تست (HK/1073/99) مورد استفاده قرار گرفت . (نتایج در شكل 3B نشان داده شده است ). بیشترین كاهش در تغییر پذیری هترودوبلكس هنگامی مشاهده شد كه آمپلیكون HK/1073/99 با آمپلیكونهای ویروس انسانی رفرنس مخلوط گردید . كه دلالت بر فاصله زیاد توالی Mژن ویروس مرغی با انسانی دارد . هترودوبلكسهایی كه هنگام مخلوط كردن محصول PCR ویروس HK/1073/99 با آمپلیكونهای رفرنس مشتق شده از ویروسهای خوكی و انسانی تشكیل شدند الگوهای تغییر پذیری گوناگونی را نشان دادند
بیشترین شباهت را با آمپلیكون PCR ویروس مرغی QU/HK/GI/97 H9N2 مشاهده شد هیچگونه هتروبلكسی هنگامی كه آمپلیكونهای Qa/hk/gi/97 و hk/1073/99 مخلوط شدند مشاهده نشد كه دلالت بر كم بودن اختلاف این آمپلیكونها از میزان حساسیت تست HMA دارد. نتایجHMA بوسیله تعیین توالی مستقیم آمپلیكونهای PCR ، Mژن از 9ویروس رفرنس وویروس تست تأئید گردید. بررسی توالی ها نشان داد كه اختلاف نوكلئوتیدی بین آمپلیكونهای Qa/hk/gi/97 و hk/1073/99 بمیزان 1/1%می باشد .

-بحث :

بیشترین شباهت را با آمپلیكون PCR ویروس مرغی H9N2 Qa/HK/GI/97 , مشاهده شد  . هیچگونه هترو دوبلكسی هنگامی كه آمپلیكونهای Qa/HK/GI/97 و HK/1073/99 مخلوط شده اند مشاهد نشد كه دلالت بر كم تر بودن اختلاف این آمپلیكونها از میزان حساسیت تست HMA دارد . نتایج HMA بوسیله تعیین توالی مستقیم آمیلیكونهای PCR ، mژن از 9 ویروس رفرنس و ویروس تست تایید گردید . بررسی توالی ها نشان داد كه اختلاف توكلئوتیدی بین آمپلیكونهای Qa/HK/GI/97 و HK/1073/99 به میزان 1/1% ازخوك یا طیور به انسان كم می باشد اما چنین وقایعی می توانند منجر به میزان بالایی مرگ ومیر می شود واحتمال پدید آمدن ویروسهای جهانی را به دنبال دارد .
تشخیص زود هنگام وتعیین خصوصیت واریانت های جدید آنفولانزا كه پدید آمده اند یكی از اهداف شبكه جهانی حفاظت درمقابل آنفولانزا سازمان بهداشت جهانی می باشد .
از این رو ، دست یابی به تستهای سریع كه بتواند ویروسهای جدید و غیر معمول كه ممكن است دارای یك منشا به صورت مخزن حیوانی باشند ضروری است . متدهای سریع ، مانند ایمونوفلورسنس و enzyme immunoassay برای تشخیص ویروسهای آنفولانزا در نمونه های كلینیكی به كار رفته اند .
گزارش شده كه روش ها دارای اختصاصیت وحساسیت متغیری هستند و مشخص نیست كه چگونه معرفهای دخیل دارای توانایی معادل در تعیین ساب تایپهای ویروسهای آنفولانزای حیوانات مختلف هستند . ارزش روشهای PCR برای تشخیص ومحافظت ویروسهای آنفولانزا در مواد كلینیكی بخوبی نشان داده شده است . روشهای تكثیر برای تشخیص و ساب تایپ كردن ویروسهای آنفولانزای A وبرای تفریق ویروسهای آنفولانزای A,B,C شرح داده شده است . لیكن این روشها به طور اختصاصی برای تشخیص ، نگهداری ویروسهای آنفولانزای انسانی طراحی شده اند وبیشتر احتیاج است كه تستهای سریع جهت تشخیص ویروسهایی كه میزبان آنها موجوداتی غیر از انسان هستند طراحی گردند ، اخیراً یك RT-PCR تك لوله ای بر پایه m ژن برای تشخیص ویروسهای آنفولانزای A مربوط به چند گونه شرح داده شده است .
دراین مطالعه ما یك متد توأم PCR-HMA را برای شناسایی وتعیین خصوصیت نسبی ویروسهای آنفولانزای A از گونه های مختلف طراحی كرده ایم .
ژنm1 بعنوان هدف انتخاب شد چراكه شواهد چنین پیشنهاد می كنند كه m1 ORF در میان ویروسهای آنفلولانزای A از گونه های مختلف میزبان به میزان زیادی حفاظت شده هستند. RT-PCR برای mژن نشان داده شده كه برای تشخیص ویروسهای آنفولانزای A ، 15 ساب تایپ مختلف با منشاء انسانی ، مرغی وخوكی اخصاصی وحساس می باشد . متدهای بعد از تكثیر برای بررسی تغییر توالی در آمپلیوكنهای PCR شامل بررسی RFLP ها و HAM ها می باشد.
ارز یابیRFLP ، محصولات m ژن PCR برای ساب تایپینگ ویروسهای آنفلانزای A انسانی و تفریق 6 ژن داخلی شامل m ژن ویروسهای انسانی H1N1,H3N2 , و ویروسهای مرغی H5N1 شرح داده شده است . اشكال احتمالی تكنیك RFLP این است كه موتاسیون در توالی نوكلئوتیدی آن مورد نظر ممكن است منجر به از دست دادن یا پدید آمدن باند شدن آنزیم محدود كننده شود . میزان بالای موتاسیون پذیری RNA ژنوم ها ، مانند ژنهای ویروس آنفولانزا احتمال رخ دادن این موتاسیونها را افزایش می دهد .
از آنجائیكه كه بررسی هترودوبلكس نشان داد كه برای تفریق سریع ویروسهای RNA دار بسیار مناسب می باشد وبدلیل اینكه سایتهای مناسب آنزیمهای محدود كننده كه ویروسهای انسانی ، مرغی وخوكی را متمایز می سازد در آمپلیكون 413 bp ژن m شناسایی شده اند ، HMA برای تعیین خصوصیات آمپلیكون m ژن انتخاب شد .
HMA بر مشاهده تغییرات توالی بین آمپلیكون های ویروس تست كه باعث پدید آمدن جفت نشدن درست با سویه رفرنس می شود ودر نتیجه هترودبلكس ها متعاقباً دناتوره می شوند ودوباره می چسبند استوار است .
هتروبكلس ها آهسته از همودوبلكس های هم اندازه خود مهاجرت می كنند وكاهش قابلیت حركت متناسب با میزان اختلاف بین دو توالی موجود درمخلوط دارد . درجه تغییر مورد نیاز برای تفریق مناسب هترودوبلكس ها نشان داده شده كه بین طیف 25 و 5% می باشد .
درجه اختلاف بین آمپلیكونهای m ژن مرغی ، خوكی ، وانسانی بینابین طیف می باشد وباعث تشكیل هترودولكس ها ی قابل تشخیص می شود . 
شیفت در mobility هترودوبلكس مشاهده شد كه مرتبط با اختلاف بین DNA تست و رفرنس بود كه اختلافی به كمی 9/1 تا 1/1 % اختلاف توكلئوتیدی قابل تشخیص بود .
این موضوع با گزارشات قبلی تعیین اختلاف 4 تا 4/1 درصدی قابل قیاس بود . در این كار بهترین تمایز بوسیله HMA هنگامی مشاهده شد كه محصولات اولیه PCR قبل از تكثیر ثانویه رقیق شد .
از این موضوع می توان نتیجه گرفت كه هنگام آزمایش مستقیم نمونه های كلینیكی كه حاوی تیترهای پائین تری از ویروس نسبت به مواد رشد كرده بر روی تخم یا سلول هستند این كار ضروری نخواهد بود .
مناسب بودن متد PT-PCR HMA ما برای جستجوی نمونه های در یك شیوع بوسیله مقایسه یك تست ویروس با یك RAMEL ویروسهای رفرنس ارزیابی می گردد . سویه آنفولانزای مرغی H2N2 ( HK/1073/99 ) بعنوان ویروس تست انتخاب گردید چرا كه این ویروس مرغی از یك بچه 4 ساله درهنگ كنگ جدا شده است.
یك ارتباط عالی بین نتیجه HMA و اختلاف نوكلئوتیدی وجود دارد برای تشخیص بوسیله تعیین توالی مستقیم وبررسی پلی ژنتیك آمپلیکونهای ویروس تست و رفرنس .
بوسیله HMA، آمپلیكون PCR رفرنس مربوط به Qa/HK/GI/97 ارتباط دارد . این ارتباط بر اساس گزارشات قبلی با 1% اختلاف توكلئوتیدی بین m ژنهای HK/1073/99 , Qa/HK/GI/97 همراه می باشد . درمجموع ، نتایج كار ما نشان می دهد كه انجام توأم HMA,RT-PCR بر روی m ژن یك ابراز قوی برای تشخیص وشناخت ژنتیك ویروسهای آنفولانزا می باشد .HMA یك راه ساده وحساس برای جستجوی m ژنهای ویروس های آنفولانزای جدا شده می باشد وفقط 36 تا 24 ساعت وقت لازم دارد . اگر چه متد RT-PCR HMA برای بررسی نمونه های دستگاه تنفس در این مطالعه مورد استفاده قرار نگرفته ولی چنین نتیجه گیری می شود كه این متد می تواند بطور مستقیم برای تست ویروسها در نمونه های كلینیكی به كار رود بدون اینكه ضرورتی به رشد ویروس اول بر روی سلولهای محیط كشت یا جنین تخم مرغ باشد .
حساسیت روش m ژن RT-PCR كه شرح داده شد قابل قیاس با حساسیت روش RT-PCR كه در آن از پرایمرهای اختصاصی ژنهای HA ویروسهای آنفولانزای B,A برای تعیین ویروسهای آنفولانزای B,A به طور مستقیم درنمونه كلینیكی می شود . ویروسهای آنفولانزای جدید وغیر معمول را كه بوسیله HMA شناسایی شده اند می توان بسیار وسیعتر بوسیله تعیین توالی مستقیم و HI تایپینگ شناسایی وتعیین خصوصیت كرد . پانل HMA ویروس رفرنس را كه ماساختیم نیاز خواهد داشت كه با اطلاعات بدست آمده از ویروسهای كه در بین انواع حیوانات درچرخش است به روز شود . سرانجام ، تكنیك تركیبی RT-PCR هترودوبلكس می تواند برای شناسایی دیگر ژنهای داخلی ویروس آنفولانزا بكار رود .

بیماریزای عصبی ویروس آنفولانزای H5N1ژنوتیپ جدا شده از طیور هنگ كنگ در 2001 در موش
خلاصه :

ما پاتوژنسیته 5 ژنوتیپ مختلف ( E تا A ) را از ویروسهای آنفولانزای مرغی H5N1 مطالعه كردیم كه حاوی ژنهای HA مشابه ویروس H5N1 A/goose /Guangdong/1/96 و 5 تركیب مختلف ژنهای داخلی در یك مدل موشی می باشد . واریانت های نوروتوپیك وبسیار پاتوژن ویروس از ژنوتایپهای A,C,D,E از مغز بعد از یك پاساژ داخل بینی در موش جدا شدند . ژنوتیپ ویروس B فقط از ششها جدا شدند .واریانت های مغز موش دارای آمینواسیدهای تغییر یافته در محصولات تمامی ژنهایشان بجز پروتئین های PB1,NP,NS1 بودند اما شامل موتاسیونهای معمول نبودند . ما نتیجه گرفتیم كه منشاء ژنوتیپی H5N1/01 از A,C,D,E بصورت هتروژنوس می باشد ودیگراینكه ورایانت های بسیار پاتوژن نوروتروپیك می توانند سریعاً در موش انتخاب شوند .

مقدمه :

شیوع ویروس آنفولانزای A,H5N1 در هنگ كنگ در سال 1997 ، 6 نفر از 18 نفری را كه عفونی شده بودند از بین بردواولین مورد مستند انتقال مستقیم ویروس آنفولانزای مرغی از طیور به انسان بود .
شیوع منجر به گسترش بیماریهای جدی كشنده شد وبعضی به آن بعنوان نخستین حالت پاندمیك اشاره می كنند .
كشتار تمام طیور در فروشگاههای فروش طیور زنده در هنگ كنگ در دسامبر 1997 باعث از بین رفتن منبع عفونت و جلوگیری از انتقال بیشتر به انسانها شد . ویروسهای H5N1 انسانی جداشده (/97 H5N1 ) تصور می شود كه بطور طبیعی از نوترتیبی ویروس های مرغی پدید آمده اند كه ژن ( HA ) هماگلوتینین بسیار با این ژن در ((A/goose/Guangdong/1/97(H5N1))) همولوگ می باشد وكمپلكس همانند ساز آن بمیزان زیادی با كمپلكس مانند ساز یروسهای (H9N2)A/guail/Hongkong/GI/97,(H6N1)Alteal/Hongkong/W312/97 مشابه می باشد .
ژن نورآمینیداز (NA ) ویروس H5N7/97 همچنین بطور نزدیك با این ژن در ویروس Alteal/Hongkong/W312/97 همولوگ می باشد .
در طول سالهای 1999 و2000 ویروسهای H5N1 شبهGO/Gd به خرچه زندگی خود در غازها درجنوب غربی چین ادامه دادند . این ویروسها با ویروسهای با منشاء مرغان آبی نوتركیبی داشتند وژنوتیپهای چندتایی ویروسهای H5N1 حاوی ژنهای NA,HA از ویروسهای شبه GO/Gd در فروشگاههای طیور هنگ كنگ بین فوریه وMay 2001 دوباره ظاهر شدند.
این ظهور دوباره ویروسهای H5N1 در پرندگان خاكی اولین بار بود كه بعد از اپیدمی دسامبر 1997 رخ می داد ومنتج به دومین میزان تلفات در طول 4 سال زندگی طیور درهنگ كنگ خصوصاً‌در ناحیه اجرائی گردید. تمام ویروسهای H5N1 جداشده از طیور در فروشگاههی خرده فروش طی زمستان وبهار 2001 نوتركیبهایی بودند كه حاوی ژنهای NA,HA در درمان GO/Gd وژنهای داخلی دیگر ویروسهای مرغان آبی بودند .
5 نوع از نوتركیب ها با ژنوتایپهای طراحی شده A,B,C,D,E مشاهده شدندد وبا توجه به منشأ فیلوژنی وساختار ژنهای داخلی گروه بندی شدند . ویروسهای تمام 50 ژنوتیپ شدیداً‌ برای جوجه ها وبلدرچین ها بیماریزا بودند همچنین تمام 5 ژنوتیپ برای موش هنگامی كه با دوزبالا باویروس عفونی تلقیح می شدند كشنده بودند . ویروسهای 4تااز 5 ژنوتیپ ازمغز موشهایی كه علائم اختلال سیستم عصبی مركزی CNS را داشتند جدا شد. پاتوژنیسته ویروس آنفولانزای A در موش معمولا نیاز به آداپته شدن با میزبان جدید ، كه طی رشد چند نسل پی درپی « پاساژهای پشت سرهم » ویروس در مغز یا ششها رخ می دهد .
مطالعه كسب بیماریزایی در طول آداپته شدن در موش نشان داد كه ویروسها آداپته شده با موش كه پنموویرولانس و نوروویرولانس هستند نشان داده كه با موتاسیون در NS,M,NA,NP,HA یك یا ده تا از ژنهای پلی مراز همراه می باشد .
برخلاف دیگر ویروسهای آنفولانزای A مرغی وانسانی ، سویه های مرغی و انسانی هنگ كنگ H5N1/97 جدا شده دارای پاتوژنیسته درموش می باشند بدون آداپته شدن . ویروسهای H5N1/97 در پاتوژنسیته برای موش هتروژنوس هستند : تعدادی از جداشده ها بسیار بیماریزا بودند و بصورت سیستمیك تكثیر می كردند درحالی كه دیگران دارای بیماریزایی كمتری بودند ودر دستگاه تنفسی تكثیر می كردند . پاتوژنز ویروسهای H5N1/97 درموش از دیگر ویروسهای شدید غیرپاتوژن H5 متمایز می باشد وشمای ملكولی فتوتیپهای H5N1/97 كه در موش بسیار پاتوژن هستند تعیین شده اند . بعلاوه ، Hatta وهمكارانش با استفاده از تكنیكهای معكوس ژنتیكی بر پایه پلاسمیدنشان دادند كه وجود یك لیزین در بنیان 627 در پروتئین PB2 ویك محل شكست پلی بازیك در HA برای بیماریزایی شدید و تكثیر سیستمیك ویروس (H5N1)A/Hongkong/483/97 درموش قطعی می باشد .
پاتوژسیته فتوتپهای كم و بسیار پاتوژن دریك مدل موش صحرائی عقیم مورد مطالعه قرار گرفته است : هر دوفتوتیپ شدیداً در موش صحرائی بیماریزا بودند بر خلاف بیماریزایی متفاوتی كه درموش دیده می شد .
پاتوژنسیته ویروس (H5N1 ) A/Hongkong/156/97 انسانی مورد مطالعه قرار گرفت . این ویروس بطور كارآمد در دستگاه تنفسی تكثیر می كند وقطعات ژنی بوسیله PCR درمغز وتعدادی ارگانهای داخلی عفونی شده تشخیص داده شدند اما هیچ گونه تكثیر سیتسمیك دراین ویروس مشاهده نشد .
درمطالعات فعلی ، ما از یك مدل موش برای تعیین خصوصیات پاتوژنسیته 5 ژنوتیپ ویروسهای H5N1 2001 هنگ كنگ درمیزبانهای پستاندار استفاده كردیم . ویروسهای 4 ژنوتیپ از 5 ژنوتیپ بعد از تلقیح به داخل بینی از مغز موش جدا شدند . ما بیماریزایی را برای موش وشمای ملكولی این واریانت های نوروپاتیك موجود در مغز موش (MB) را با ویروس جدا شده با منشاء H5N1/01S را مقایسه كردیم نتایج دال بر تاثیر ژنهای داخلی بر روی پاتوژنسیته ویروسهای H5N1 مرغی در میزبانهای پستاندار و احتمالاً انتخاب سریع واریانت های بسیار پاتوژن و نورویرولانت می باشد .

ویروسها :

ویروسهای 5 نوع H5N1 مرغی ، از هر 5ژنوتیپ كه در بهار سال 2001 در هنگ كنگ جدا شدند در این مطالعه مورد استفاده قرار گرفتند.
Genotype A,A/chicken/Hongkong/yu822.2/2001(ch/hk/yu822.2/01)
Genotype B,A/chicken/Hongkong/yu562/2001(ck/hk/yu562/01)
Genotype C,A/pheasant/Hongkong/Fyl55/2001(ph/HK/Fy155/01)
GenotypeE ,A/Chicen/Hongkong/NT87303/2001(CK/HK/NT87303/01).
ویروسها بوسیله یك پاساژ در جنین تخم مرغ جدا شدند . برای آماده سازی استوكها برای مطالعه درموش ، ویروسها قبلا برای یك بار بیشتر در حفره آلانتوئیك جنین 10 روزه جوجه برای 48تا40 ساعت در دمای c370 پاساژ داده شدند .
مایع آلانتوئیك حاوی ویروس خالص سازی شدند ومیزان عفونت زائی آنها در تخم مرغ ها تیتر شد . تیترهای ویروس بعنوان log10 -50% از دوز عفونی كننده تخم مرغ در ml1/0 از مایع بیان می شد . (log10 50% EID50 per0.1 ml) با توجه به متد Reed , Muench . استوكهای ویروس به دو دسته زنده وتازه و دسته نگهداری شونده در 80- تا موقع مصرف تقسیم بندی شدند .
تمام مطالعات با ویروسهای H5N1 در سطح +3 ، Biosafty انجام گرفت آزمایشگاه توسط بخش كشاورزی ایالت متحده دراختیار محققین گذارده شد .

بیماری زائی وتمایل بافتی ویروس H5N1 اصلی جدا شده از موش :

موش ماده 5/1 ماهه BALB/C برای این مطالعات مورد استفاده قرار گرفتند . برای تعیین 50% دوز كشنده در موش ( MLD50) ، 4گروه ازموشها بوسیله استنشاق ایزوفلوران بیهوش شدندوبا ml 1/0 از مایع آلانتوئیك در سالین بافرفسفات بصورت تلقیح داخل بینی عفونی شدند (PBC ) « 10 رقت پشت سرهم از تا حیوانات روزانه وزن شدند و برای 20 روز تحت نظر گرفته شدند .
تیتراسیون MLD50 نشان داد كه تمامی 5 ژنوتیپ ویروسهای H5N1/01 از گروه دارای پاتوژنسیته كم در موش بودند به همین دلیل آنها بطور قابل توجه ای ایجاد بیماری ومرگ ومیر فقط در روز بالا ایجاد می شد .« جدول 1»
بدلیل اینكه ویروسها دارای ارزشهای EID50 مشابه بودند مارقت از مایع آلانتوئیك را كه حاوی تقریباً از ویروس به عنوان دوز عفونی برای مطالعات بیشتر بر روی پاتوژنسیته انتخاب شدند . گروههای 18 تا 26 موش ها با ml 501 از مایع آلانتوئیك رقیق شده با PBS بصورت داخل بینی مورد تلقیح قرار گرفتند .
3 موش از هر گروه در روزهای 3و7 بعد از تلقیح برای تعیین تیتر ویروس در ریه كشته شدند « روز 3 » ودر مغز و ارگانهای داخلی « روز 3و7» .
موش باقی مانده در هر گروه بصورت روزانه وزن شدند وبرای 20 روز تحت جهت مشاهده علائم بیماری ومرگ ومیر تحت نظر گرفته شدند .
شش ها ، مغز ، طحال ، كبد ، كلیه ، وقلب هر موش مرده یا حیواناتی كه مرحله پایانی بیماری كشته می شدند خارج شدند . ارگانها در PBS سرد شسته شدند ، وزن شدند، له شدند ودر PBS سرد با آنتی بیوتیكها برای به دست آوردن یك هموژن 10% هموژنیزه شدند . ناخالصی های نمك بوسیله سانتریفیوژ كردن درz,000 g برای 10 دقیقه ته نشین شدند .
بافت هموژن نشده به درون حفره آلانتوئیك جنین 10 روزه تخم مرغ تشخیص محدوده پائین تر ویروس 0.1log10 EID-DO/0.1ml از بافت هموژن می باشد .
3تا7 روز بعد از تلقیح هیچ ویروسی در مغز یا ارگانهای داخلی موش قابل تشخیص نبود. لیكن ویروس در مغز وارگانهای داخلی موش كه علائم نورولوژیك را نشان می داد 8تا10 روز بعد از تلقیح قابل تشخیص بود « بطور عمده فلج پای عقب »
نتایج بررسی پاتوژنسیته وبافت گرایی 5 ژنوتیپ H5N1/01 را به سه گروه تقسیم می كند . گروه اول شامل ویروسهای ژنوتیپهای A,B هستند كه ابتدا در ریه های موش همانند سازی می كنند . عفونی شده با ویروس CK/HK/YU822.2/01 ، ویروس از شش ها ، مغز وارگانهای داخلی جدا شده ویروس به میزان كافی درمغز این حیوان همانند سازی كرده بود . تیتر ویروس CK/HK/YU822.2/01در كبد ، طحال وكلیه خیلی پائین بود .
« ویروس فقط از بافت هموژن رقیق نشده جدا شد .» ویروس ژنوتیپ B فقط درشش های موش عفونی قابل تشخیص بود . عفونت با این ویروس باعث 55% مرگ ومیر گردید. گروه دوم متشكل از فقط یك عضو بود . ph/HK/FY155/01 ( ژنوتیپ c) ، كه در شش ها ومغز عفونی موش همانند سازی می كند .
عفونت با این ویروس منتج به بیشتر میزان مرگ ومیر گردید . این ویروس از مغزهای موش كه دارای فلج پیشرفتهای عقبی بود وتلف شده بود یا اینكه در روزهای 7تا10 بعد از تلقیح كشته شده بود جدا شد .29% از حیوانات تلف شده « 7/27 % از عفونی ها » دارای ویروس درمغز بودند .
ویروس ژنوتیپ c در شش ها ومغز موش با تیترمشابه ای ، كه حداكثر میزان را نسبت به بقیه ژنوتیپ ها داشت همانند سازی كردند.
گروه سوم ، شامل ویروسهای ژنوتیپ D,E كه همچنین در شش ها مغز موش عفونی تكثیر می كنند باشد اما بیشتر از ژنوتیپهای دیگر نوروتروپیك هستند ، تمام موشهایی كه بعد عفونی شدن بااین ویروسها مردند دارای ویروس در مغز بودند . نرخ مرگ ومیر موش عفونی شده با CK/HK/FY150/01 « ژنوتیپ D »
و CK/HK/NT873.3/01بترتیب 5/61% و 3/33% می باشند . موش های عفونی شده با ویروسهای ژنوتیپ E,D دچار فلج پای عقبی ، paresis , tremors قبل از مرگ در 10 تا 14 روز بعد از تلقیح می شدند .

پاتوژنسیته وتمایل بافتی واریانت های H5N1 جدا شده از مغز موش :

واریانت های نوروتروپیك ویروسهای اصلی ژنوتیپهای A,C,D,E « واریانت MB» از مغز بوسیله كشت مغز هموژن ویروس مثبت در تخم مرغ جنین دار 10 روزه با یك با پاساژ جدا سازی شدند .
ارزش EID50 , MLD50 همانطور كه در بالا شرح داده شد تعیین گردید . برای مطالعه پاتوژنسیته وتمایل بافتی ، گروههایی متشكل از 4 حیوان بصورت درون بینی با ml 1/0 از مایع آلانتوئیك رقیق شده باPBC حاوی تا از ویروس عفونی مورد تلقیح قرار گرفتند .
مغز ، شش ها و ارگانهای داخلی موش كه مرده بود یا در مرحله پایانی بیماری كشته شده بود خارج شدند .
واریانت های CK/HK/YU822.2/01 , MB, Ph/HK/FY155/01 –MB, CK/HK/FY150/01 –MB , CK/HK/NT87303/01 –MB طراحی شدند بطور قابل توجه ای از ویروسهای اصلی بیماریزاتر بودند . این واریانت ها ارزش MLD50 مشابه با ارزش EID50 آنها داشت كه دلالت بر پاتوژنسیته بالای این ویروسها برای موش دارد . واریانت های MB با توجه به تمایل بافتی شان دریكی از دو گروه قرار می گیرند .
گروه اول شامل واریانت های با پاتوژنسیته بالا از ژنوتیپهای A,C می باشد كه بصورت سیستمتیك تكثیر پیدا می كنند و مغز وارگانهای داخلی را عفونی می سازند . دوزهای بسیار عفونی كننده از این واریانت های MB منتج به مرگ در روزهای 3و5 شده ،‌دوزهای پایین تر موشها را 6 تا 11 روز بعد از تلقیح می كشد . تلقیح با دوزهای تا از هر دو ویروس سبب ایجاد علائم نورولوژیك مانند فلج پاهای عقبی ، tremor , paresis گردید.
تیتر ویروس واریانت MB از ژنوتیپ های A,C در كبد و طحال وكلیه وقلب حداقل log102 تا 5/3 پایین تر از تیتر آنها در شش ها ومغز بود ، جایی كه واریانت ها بطور كافی همانند سازی می كنند . این نتیجه پیشنهاد می كند كه این واریانت ها ی MB پنموتروفیك ونوروتروفیك هستند .
گروه دوم شامل واریانت های MB از ژنوتیپ E,D هستند كه فقط در شش ها و مغز موش های عفونی تشخیص داده شده اند .
واریانت ژنوتیپ D موش را 4تا8 روز پس از تلقیح می کشدومیزان EID5025/1 10از وریروس عفونی باعث فلج پاهای عقب و Paresis در روزهشتم بعد از تلقیح می شود . واریانت MB از ژنوتیپ Dدر شش ها ومغز تمامی موشهای مرده یا كشته شده تشخیص داده شدند .
پاتوژنسیته CK/HK/NT873.3/01- MB « ژنوتیپ E» مشابه با واریانت ژنوتیپ D می باشد ، بیشتر حیوانات در روز نهم مردند وعلائم نورولوژیك درموش عفونی شده با دوزهای 25/3 10 و 25/2 10 و 25/1 10 EDI56 مشاهده شد . ویروس ژنوتیپ E از شش ومغز هر حیوان تلف شده یا كشته شده جدا شد . تیترهای واریانت های ژنوتیپ درشش ها ومغز مشابه بودند .

بررسی هیستوپاتولوژیك :

با تغییرات لوكالیزه پاتولوژیك در CNS باعث بروز علائم نورولوژیك می گردد ، نمونه های مغز وطناب نخاعی موش عفونی شده با CK/HK/YU822.2/02 – MB
« ژنوتیپ A» وموشهایی كه درمرحله پایانی بیماری از بین رفتند در بافرخنثی فرمالین 10% فیكس گردیدند ، درواكس پارافین تثبیت شدند ، برشهای 5 زده شدند ، با هماتوكسیلین وائوزین رنگ شدند و برای تغییرات هیستوپاتولوژیكال مورد ارزیابی قرار گرفتند.
دژنره شدن نرونها ونوروفاژیا با التهاب در اثر فیلتر نشدن گلرانولوسیتها وسلولهای مونونوكلوئر به ناحیه ساقه مغز و طناب نخاعی محدود می شد .
انفیلتراسیون سلولهای منونوكلوئر همچنین در مننژها و در فضاهای Prevascular ساقه مغز و neuropil طناب نخاعی دیده می شود .
در طناب نخاعی ، همچنین یك دژنره شدن معمول سلولهای گلیال را داریم ونرونهای با كروماتین های حاشیه ای ویك انكلوژن ائوزینوفیلیك كه به طور نسبی یا كاملا هسته را پر می كند . دژنراسیون نرونی و انفیلتراسیون التهابی همچنین در تعدادی از ریشه های dorsal گانگلیا مشاهده شد وتعداد زیادی از كانونهای نكروزه وسلولهای التهابی به همراه بافت تخریب شده مشاهده گردید.

مرفولوژی پلاك :

یكی از خصوصیات مهم ویروسهای آنفولانزا در توانایی تشكیل پلاك در سلولهای كشت داده شده می باشد . همانند پاتوژنسیته ، این خصوصیت می تواند طی انتخاب شدن در موش تغییر پیدا كند . مرفولوژی پلاك می تواند منعكس كننده هتروژنسیتی جمعیت ویروسی باشد . ارزیابی پلاك در سلولهای MDCK همانطوری كه در قبل شرح داده شد انجام می گیرد . ویروسهای با منشاء ژنوتیپ های A,B,C,D تشكیل پلاكهای بزرگ را كه بخوبی قابل تشخیص می باشد می دهند كه این از خصوصیات ویروسهای آنفولانزای مرغی بسیار پاتوژن می باشد . ویروس ژنوتیپ ( CK/HK/NT873.3/01 ) E پلاكهای كوچك و كدر را تشكیل می دهد.
پلاكهایی كه بوسیله ویروسهای با یك منشاء تشكیل می شود هموژنوس بودند . پلاكهایی كه بوسیله واریانت های MB تشكیل می شدند بزرگترازآنهایی بودند كه بوسیله منشاء تشكیل می شد و واریانت MB ژنوتیپ (CK/HK/NT873.3/01 – MB ) پلاكهایی را تشكیل می دهند نسبت به پلاكهای ویروس منشاء بهتر شناسایی شده است . هیچ پلاكی مانند آنهایی كه بوسیله واریانت های MB در سلولهای MDCKعفونی شده با ویروس های منشاء مشاهده می گردد تشكیل نمی شود .
افزایش مشابه دراندازه پلاك در واریانت های MB ژنوتیپهای C,D مشاهده گردید .

مقایسه توالی های ویروسهای منشأ و واریانت های MB

مطالعات در موش نشان می دهد كه تلقیح منشاء ویروسهای H5N1/01 جداسازی شده از ژنوتیپ های A,C,D,E درموش منتج به انتخاب واریانت های بسیار پاتوژن وعصب دوست می شود . با مقایسه تمام ملكول ایزوله های منشاء و واریانت های MB و تعیین اساس ملكولی بیماریزای در موش وتمایل به عصب ، تمام ژنهای پدید آورنده واریانت های MB تعیین توالی شدند .
RNA ویروسی از مایع آلانتوئیك حاوی ویروس با استفاده از RNeasyminikit جدا سازی شد . پرایمر uni-12 برای نسخه برداری معكوس مورد استفاده قرار گرفت .
PCR با دسته ای از پرایمرهای عمومی كه برای قطعات ژنی ویروسهای آنفولانزای A اختصاصی می باشد انجام شد . محصولات PCR با كیت خالص سازی سریع PCR (QIA ) خالص سازی شدند. عملیات تعیین توالی و بررسی نمونه ها درمركز بیوانفورماتیك وبیوتكنولوژی Harwell در بیمارستان تحقیقاتی كودكان St.Jvde انجام گرفت . تعیین توالی DNA كامل شد ، ویرایش شد ، ترجمه گردید وبا استفاده نرم افزار بررسی توالی به نام Lasergene بسته بندی گردید .
بررسی فیلوژنیك توالی های كل ژنوم از ژنهای واریانتهای MB H5N1/0 ، ویروس منشاء و CK/HK/YU562/01 ( ویروس ژنوتیپ B كه از مغز موش جدانشده بود) نشان داد كه ایزوله های منشاء دارای همان پراكندگی مشابه 5ژنوتیپی هستند همانطوری كه قبلاً براساس تعیین توالی نسبی توالی مشاهده شده بود .
واریانت های متمایل به عصب جدا شده از مغز موش متعلق به دسته مشابه ای از ژنوتیپها بود همانطوری كه در ابتدا درموش به طریقه داخل بینی تلقیح شده بود.
تغییرات توالی های آمینواسیدی بین ویروس های original و واریانت های MB آنها با آنهایی كه بین فنوتیپهای موش H5N1/97 انسانی با پاتوژسیته بالاوپایین یافت میگرد مقایسه گردید. تغییرات آمینواسیدی در واریانت های بسیار پاتوژن در تمام محصولات ژنی وجو داشت بجز پروتئین های NS1,NP,PB1 بیشترین تغییرات ویروسهای original رااز واریانت های MB متمایز می ساخت ، همانطور كه از دیگر ویروسهای با پاتوژنسیته بالاو پایین تمایز می ساخت وآنها منحصر به فردنبودند . طبیعت اتفاقی این تفاوتها پیشنهاد می گردد كه ویروسها هتروژنوس هستند ودلالت می كند براینكه احتمال انتخاب سریع واریانت های بسیار پاتوژن وجود دارد .
این پیشنهادات بوسیله هتروژنسیته توالی های original از ژنهای PA,PB2 تایید می شود بخصوص در ژنوتیپ های A,C,D . واریانت MB از ژنوتیپ A(CK/HK/YU822.2/01 – MB ) از ویروس original بوسیله تغییرات منحصر به فرد در بنیان 738 در PB2 پلی مراز ، بنیان 10 و 212 در PA پلی مراز ، بنیان 50 در HA وبنیان 86 در NS2 وبوسیله حذف 20 آمینواسیدوجانشینی G به جای S70 در NA متمایز شدند . واریانت MB از ژنوتیپ C دارای 4 آمینو اسید منحصر به فرد بودند كه در موقعیت های 305 و 307 و 627 در PB2 ودر موقعیت 501 در PA در واریانت MB از ژنوتیپ D یك جانشینی منحصر به فرد در بنیان 97 در PA وجود دارد در حالیكه واریانت MB از ژنوتیپ E دارای چنین تغییراتی نبود . این موتاسیونهای منحصر به فرد ممكن است در اكتساب بیماریزای بالا و بیماری زای برای عصب در واریانت های MB دخیل باشند .
عدم وجود چنین تغییرات منحصر به فردی در واریانت MB از ژنوتیپ E می تواند در ابتدا بوسیله نوروتروپیسم بالا وبیماریزائی پایین ویروسهای original جدا شده از موش شرح داده شود. تغییرات متعاقب در واریانت MB ممكن است دارای اثر بیماریزائی داشته باشد ولی اثر نورویرولانس ندارد .
هتروژنیستی پاتوژنسیته آنها درموش نتیجه یك اختلاف كوچك در توالیهای ژنومهای ویروسی بود . در مقابل ویروسهای H5N1 جدا شده از فروشگاههای طیور هنگ كنگ ر سال 2001 از 5 ژنوتیپ مختلفی كه به طور طبیعی وجود داشتند بودند . این ویروسهای H5N1/97 و H5N1/01 به طور معمول فقط دارای ژن NA « كه از نظر فیلوژنیكی نزدیك به ویروسهای شبه GO/Gd می باشند » ویروسهای شبه GO/Gd كه در سال 1999 در هنگ كنگ جدا شدند. جدژنهای HA,NA وتعدادی از ژنهای درونی ویروسهای H5N1/01 بودند كه نشان داده شده دارای بیماریزایی كمی درموش بوده اند : این ویروسها به طور موثر در ششهای موش همانند سازی می كردند وفقط یكی از آنهایی كه جدا شدند ومورد مطالعه قرار گرفته اند به میزان خیلی كم درمغز ردیابی شده اند مافهمیدیم كه بیشتر ویروسهای H5N1/OS original همانند ویروسهای H5N1/99 شبه GO/Gd دارای پاتوژنسیته كمی در موش بودند وبه بافت عصب نیز تمایل داشتند . لیكن بر خلاف ویروسهای شبه GO/Gd ویروسهای H5N1/01 چها تار از 5 ژنوتیپ A-E در مغز موش قابل تشخیص بودند . زخمهای اختصاصی ویروس در ساقه مغز وطناب نخاعی وجراحات التهابی ریشه های بالایی گانگلیا دلالت می كند بر اینكه این واریانتهای MB نوروتروپیك از ششها به مغز به طریق انتقال سیناپسی بوسیله اعصاب حسی منتشر می شوند .یك مسیر انتقال عصبی ویروس هم همچنین در موش عفونی شده با ویروسهای مرغی H5N3 كه درجوجه ها اداپته و بسیار بیماریزا شده بودند ، مشاهده شد . ویروس ژنوتیپB به طور موثر در ششهای موش همانند سازی می كنند و سبب مرگ ومیر می شوند . اما درمقابل ویروسهای ژنوتیپ A,C,D,E ویروس ژنوتیپ B از مغز جدا نشد . تلقیح موش با واریانتهای MB جدا شده از مغز نشان می دهد كه این واریانتهادر موش بسیار بیماریزا هستند وحداقل دارای بیماریزای مشابه در موش هستند همانطور كه ویروسهای H5N/97 با فتوتیب بسیار بیماریزا این كار را انجام می دهند . انتخاب واریانت نوروتروپیك از 5 ژنوتیپH5N1/01 طی تكثیر در موش سریع به وقوع می پیوندد واریانتهای MB بسیار پاتوژن فقط طی یك پاساژ ویروس تولید می شوند. چنین انتخاب سریعی احتمالاً بوسیله اقامت طولانی غیر معمول این ویروسها در ششها امكان پذیر می گردد «ما این ویروس را از ششهای موش در روزهای 8 تا 12 بعد از تلقیح جدا كردیم . » یافته های ما دلالت می كند براینكه ارقام ژنهای داخلی در ویروسهی H5N1/97 كه از چرخه حیات بوسیله كشتار تمامی طیور در سال 1997 خارج شد .
فقط تركیب ژنها نبود كه منبع به پاتوژنسیته بالای این ویروس در طیور وپستاندران شد : قطعات مختلف چندتایی ژن داخلی ویروسها كه به طور رایج درجنوب شرقی چین درچرخه هستند می توانند كامل بكنند ژن HA ویروس شبه GO/Gd برای تولید ویروسهای كه بسیار بیماریزا هستند و در میزبان پستاندار خاصیت نوروتروپیك دارند. بنابراین HA ویروسهای شبه GO/Gd كه دارای سایتهای برش چندتایی هستند ممكن است یك نقش كلیدی را در بیماریزای ویروسهای مرغی H5N1 هنگ كنگی در گونه های پستاندران فقط هنگامی كه بوسیله یك تركیب مناسب با ژنهای داخلی كامل شوند ایفا كنند .
ویروس ژنوتیپ A ازنظر داشتن ژنهای PA,M از رده فیلوژنیك شبه GO/Gd با ژنوتیپ B متفاوت است. ژنوتیپهای C حاوی ژنهای NP,BP1 از ویروسهای شبه GO/Gd است كه این ژنها ژنوتیپ C را از ژنوتیپ A,B متمایز می سازد.
ژنوتیپ های D,E فقط در ژن NP شان با همدیگر وباژنوتیپ C فرق می كند ویروس ژنوتیپ B حاوی ژنهای HA,NA ای است كه از نظر فیلوژنی به ویروسهای شبه GO/Gd نزدیك می باشد این ژنها باعث می شوند كه این ویروسها در رده پرندگان وحشی دریایی ناشناخته باقی بمانند . ما پیشنهاد می كنیم كه جمعیت ویروسی ژنوتیپ B هموژنوس می باشد . چرا كه هیچ واریانت بسیار پاتوژنی از این ژنوتیپ طی یك پاساژ در موش انتخاب نمی شوند . ژن HA از ویروس ژنوتیپ B كه دارای سایتهای برش چندتایی كه از ویروسهای شبه GO/Gd منشاء گرفته اند به تنهایی كافی نیستند . تا معرف یك ویروس با بیماری زایی بالا و نوروتروپیسم در موش حداقل طی یك پاساژ باشد .
درمقابل جمعیت ویروس ژنوتیپ B جمعیتهای ویروسی ژنوتیپ های A,C,D,E هتروژنوس هستند چرا كه یك پاساژ از این ویروسها درموش منجر به انتخاب واریانتهای بسیار پاتوژن می شوند . مقایسه توالی ها بین واریانتهای MB وفتوتیپ ویروسهای H5N1/97 هنگ كنگی كه برای موش بسیار پاتوژن هستند و ویروسهای اداتپه شد . با موش هیچ گونه از سریهای معمول موتاسیونها را نشان نمی دهد .
فقط جانشین K به جای E627 در PB2 در واریانت MB ژنوتیپ C كه مشاهده شده مشابه موتاسیون بود كه مسئول بیماریزایی بالایی ویروس HK/483/97 بود اما این موتاسیون فقط در ویروس ژنوتیپ C یافت می شد . فقدان یكسری موتاسیونهای رایج در واریانتهای بسیار پاتوژن و نوروتروپیك پیشنهادمی كندكه راههای مختلف زیادی برای ویروسهای آنفلونزای H5N1/01 هنگ كنگی برای دستیابی به بیماری بالاونوروتروپیسم در موش وجود دارد . شرط لازم برای نوروویرولانس ویروسهای H5N1/01 هنگ كنگی درموش وانتخاب سریع فنوتیپ های بسیار پاتوژن در میزبان جدید ممكن است به دلیل شكل گیری ویژه كمپلكس ژنهای همانندساز باشد .
محلهای برش چندتایی در HA ضروری می باشد . اما برای اینكه این ویروسها را بسیار پاتوژن ونوروویرلانت در موش باشد كافی نمی باشد ، تغییرات اختصاصی در پروتئینهایPA,PB2 پلی مراز در این فرایند دخیل هستند بنابراین ما حدس می زنیم كه انتخاب واریانتهای بسیار پاتوژن نوروتروپیك طی نوترتیبی طبیعی بوسیله بالا رفتن هتروژنسیته ویروسی از اضافه شدن ژنهای PA « ژنوتیپ A و PB2 « ژنوتیپهای C,D,E» از منشاء شبه GO/Gd به زمینه كمپلكس همانند ساز از یك رده فیلوژنی دیگر تسهیل می شود . سوال در مورد ارتباط پاتوژنسیته ویروسهای H5N1 هنگ كنگی در موش باتوانایشان در بیماریزای در انسان ودیگر گونه های پستانداران منطقی می باشد . لیكن انتخاب سریع واریانتهای نوروتروپیك درموش ارتباط نزدیكی با انتخاب سریع مشابه واریانتهای بیماریزا برای پستانداران دارد . تصمیم كشتار طیور در هنگ كنگ در سال 2001 یك راه مفید برای ریشه كنی این ویروسها وجلوگیری از انتخاب چنین واریانتهای بسیار پاتوژنی بود .

Accession توالیهای نوكلئوتیدی

توالیهای نوكلئوتیدی بدست آمده دراین مطالعه در ژن بانك تحت شماره از Accession
AY221592 تا AY221521 نگهداری می شود .
ارزیابی ویروسهای آنفولانزای H5N1 در اردكهای جنوب چین

خلاصه :

پاتوژنسیته ویروسهای آنفولانزا در پستاندران از اواسط دهه 1980 مورد ارزیابی قرار گرفت . دراینجا ، نشان می دهیم كه ویروسهای آنفولانزای H5N1 ، كه از اردكهای به ظاهر سالم mainland چین از سال 1999 ، تا 2002 جدا شده اند ، بطور تصادفی پاتوژنسیته آنها برای پستانداران بالا رفته است ، وبطور فرضی مكانیسم این ارزیابی مستقیم را شرح می دهیم . 21 ویروس از اردكهای بظاهر سالم در جنوب چین از سال 1999تا 2002 جدا شدند كه تایید شد اینها تحت تیپهای ویروس آنفولانزای A , H5N1 می باشند .این ویروسهای جدا شده از نظر آنتی ژنتیكی به ویروس H5N1 A/GOOSE/Gvangdong/1/96 مشابه می باشند كه منبع ژن هماگلوتینین آنفولانزای پرندگان در هنگ كنگ در سال 1997 بود و تمامی آنها در جوجه ها بسیار بیماریزا بودند .
ویروسها به 4 پاتوتیپ بر اساس همانند سازی و قدرت كشندگی برای موش تقسیم بندی شدند . یك الگوی واضح در افزایش تصاعدی بیماریزای این ویروسهای جدا شده در مدل پستانداری وجوددارد . 5 تا از 6 H5N1 جدا شده در مرغابی هایی كه مورد تلقیح قرار گرفتند همانند سازی كردند وآنها از مجرای كلوآكه وتراكه ریزش ویروسی داشتند ولی هیچ كدام علائم بیماری را نشان نداند واز بین نرفتند . بررسی فیلوژنیك ژنوم كامل دلالت بر این امر دارد كه بیشتر ویروسهای نوترتیب حاوی ژن شبیه A/GOOSE/Guangdong/1/96 هماگلوتینین هستند و دیگر ژنها از ویروسهای ناشناخته روسی می باشد . این مطالعه بر روی تعین خصوصیات ویروسهای آنفولانزای H5N1 كه اخیراً‌ در میان اردكهای mainland چین در چرخش است متمركز می باشد . یافته های ما پیشنهاد می كند كه یك تلاش سریع و بلادرنگ برای جلوگیری از انتقال ویروسهای آنفولانزای مرغی بسیار پاتوژن از اردكهای به ظاهر سالم به جوجه ها یا میزبانهای پستانداری ضروری می باشد .

مواد وروشها
جدا سازی ویروس وشناسایی آن :

بعد از شناسایی ویروس A/Goose/Guang/1/96 (GSGD/1/96) (H5N1) بعنوان یك پیش ساز مهم ویروس آنفولانزای هنگ كنگی سال 1997 (HK/97) مراقبتهای روتین برای آنفولانزای مرغی توسط مسئولین در شهرهای Castol چین و استان های Guangdong , Guanxi,Fujian , Zhejiang , Shanghai شروع شد .
نمونه های كلوآك از اردكهای به ظاهر سالم مزارع گرفته شدند . ویروسها در جنین تخم مرغ همانطوری كه در رفرنس توضیح داده شده جداسازی شدند . تمام 21 ویروس H5N1 بوسیله تست های جلوگیری از هماگلوتیناسیون ( HI ) ونورآمینیداز « NI» با یك جدول آنتی سرمی كه بوسیله دفتر بین المللی آزمایشگاه رفرنس به نام Des Epizooties محدود در چنین اختصاصی _ بیماریزا وتخم مرغ آزاد بطور بیولوژیكی كلون گردید . تمامی آزمایشات با ویروسهای H5N1 جدا شده در یك سطح biosafety با امكانات 3 آزمایشگاه انجام گرفت وآزمایشات بر روی حیوانات در isolator های با هوای فیلتر شده وضریب كارآیی بالا ( HEPA – filtered ) انجام گرفت .
آزمایش حیوانات ، جوجه ها :برای تعیین پاتوژنسیته ویروسهای جدا شده شاخص بیماریزائی V 10 ( IVPI ) تست شد با توجه به دستور كار دفتر بین المللی DesEpizooties .
گروههای 10 تایی جوجه های سفید Leghorn ، 6 هفته واختصاصی و عاری از عوامل پاتوژن در قفس های جدا كننده نگهداری شدند وبا 2/0 ml از یك رقت 10/1 مایع آلانتوئیك عاری از باكتری وحاوی ویروس بصورت 10v مورد تلقیح قرار گرفتند .
10 جوجه اضافی بطریقه داخل بینی ( x10 ) با 6 10( eID50 ) egg 50% infeetive dose از هر ویروس در یك طیف 1/0 ml مورد تلقیح قرار گرفتند ، در روز سوم ، 3 تا از جوجه های هر گروه تلف شدند ومیزان ویروس در نمونه های شش ، bursa ، كلیه ، تیموس ، غده تیروئید ، مغز ، قلب ، پانکراس ، ماهیچه معده ، طحال وتراكه تعیین تیتر گردید . تست های مشابه بر روی پرندگانی كه تلف شده بودند انجام شد . این بافتها همچنین از نظر هیستوپاتولوژیكی مورد مطالعه قرا گرفتند ، آنهادر بافر خنثی محلول سیلین 10% فیكس شدند وبا هماتوكسیلین وائوزین رنگ شدند . نمونه های فیكس نشده برای عفونت زائی ویروس درجنین های تخم مرغ تیتر شدند .
موش :گروههای 8 تایی موش های ماده BALB 6 تا 8 هفته كمی با CO2 بیهوش شدند وبصورت n 10 با 0.610 ( CID50) از ویروسهای آنفولانزای H5N1 در یك طیف 50 ml مورد تلقیح قرار گرفتند.
موش كنترل با PBS تلقیح شد . در روز 3 ، سه تا از 8 موش را برای تیتر كردن میزان ویروس در شش ها ، كلیه ها ، طحال ، ومغز كشته شدن . دوز حداقل كه 50% موشها را می كشد ( MLD50 ) بوسیله متد Muench , Reed محاسبه شد .
اردكها :گروههای 5 تایی از اردكهای 3 هفته بطریقه x10 با 85.7 10 تا 5.8 10 ( eIO50 ) از ویروس آنفولانزا در 1/0 ml مورد تلقیح شدند . اردكها روزانه برای 10 روز از نظر بروز علائم بیماری تحت نظر گرفته شدند . نمونه های سوآپ كلوآك و oropharyngeal ازتمامی اردكها ، 3 و 5 روز بعد از تلقیح برای تیتراسیون ویروس در تخمها جمع آوری شدند .
بررسی ژنتیكی وفیلوژنیكی : RNA ویروسی از مایعات آلانتوئیك بوسیله استفاده كیت RNeasy , Mini خالص سازی شدند و نسخه برداری معكوس شدند . تكثیر با PCR بوسیله استفاده از پرایمرهای اختصاصی قطعات انجام گرفت . محصولات PCR با Kit خالص سازی QIA-quick PCR خالص سازی شدند و با استفاده از كیت Quick start – CEQDTCS بر روی یك DNA سكوانسر CEQ8000 تعیین توالی شدند . اطلاعات مربوط به توالی هابا برنامه SEQMAN نوشته شدند وتوالی های نوكلئوتیدی مقایسه شدند ودرخت فیلوژنیك با برنامه MEGALIGN با استفاده از الگوریتم مسیر GLSTAL ساخته شد .
شماره Accession توالی های نوكلئوتیدی : توالی های نوكلئوتیدی كه در این مطالعه به دست آمدند از ژن بانك با شماره :
( accession nos . AY585357 – AY85524 ) قابل دسترسی هستند .

نتایج :

بررسی آنتی ژنیكی : تستهای HI , NI با آنتی سرمهای رفرنس نشان داد كه هر یك از ویروسها تحت تیپهای H%N! می باشند . ویروسها دارای الگوی مشابه واكنش HI < NI هیچ گونه شواهدی دال بر دریفت آنتی ژنتیكی در ویروسهای جدا شده از 1999 تا 2002 وجود ندارد بعنوان مثال تیترهای هترولوگوس HI كمتر از 4 بود – تا خوردگی كمتر از تیترهای هترولوگوس HI بود .
مطالعات در جوجه ها : ما از IVPI وروش پیشنهادی دفتر بین المللی Des Epizooties برای ارزیابی بیماریزایی ویروس درجوجه ها استفاده كردیم .
تمام جداشده ها ، با این معیار بیماریزا بودند « جدول 1 » . لیكن یكی از آنها زودتر جدا شدند ( OKGX/07/99 ) فقط نیمی از جوجه هایی را كه به صورت V10تلقیح شده بودند كشتند. ومیانگین زمان مرگ (MDT) دو تا از جدا شده های اولیه 8 روز بعد ازر تلقیح به صورت x 10 بود . ویروسهای H5N1 جدا شد در سال 2000 تنوع در MDT
(807 تا 303 ) بعد از تلقیح به صورت x 10 نشان دادند ، در حالی كه نمونه های جداشده در سالهای 2002 و2001 دارای MDT بین 7/1 و4 بعد از تلقیح x 10 بودند ( تنها استثناد DKGX/53/02 بود كه یك MDT بیش تر از 5/6 بود ) .یك تمایل به زیاد شدن افزایش در IVPA در وقت اضافی وجود دارد . در 7 تااز نمونه های جدا شده در 1999 و 2000 IVPA 3-9/2 بود. استثناء DKGX/53/02 بود كه IVPA آن 1/2 و MDT بیش تر از 5/6 روز داشت كه دال بر پاتوژنسیته خیلی كمتر می باشد ، تمام جوجه هایی كه در روز 2و3 بعد از تلقیح مردند دارای جراحاتی بودند كه دلالت بر همانند سازی سیستمیك ویروس می كرد . آنها دارای نكروز متوسط بافت مغز ، پنومونی شدید هیستوسایتیك همراه با ادم ، نكروز حادپانكراس ، نكروز خفیف طحال ، نفروزیس حاد یا ضعیف و نكروز خفیف تا حاد بورسابودند . فقط شواهد مربوط به DKGX/07/99 دال بر تكثیر غیر سیستمیك داشت .

مطالعات در موش :

بیشتر ویروسهای شدیداً پاتوژن آنفولانزای مرغی روسی جدا شده از سال 1997 قادر به تكثیر در پستانداران بودند . قبل از تست كردن بیماریزایی آنها در موش ، ما بطور بیولوژیكی هر ویروس جداشده را بوسیله 3 چرخه محدود رقت در جنین های جوجه اختصاصی – بیماریزا وبدون جنین كلون كردیم .
هیچ پاساژ كوری در موش انجام نشد . اطلاعات ما از یك پاساژ x 10 در موش به دست آمده اند .
بر اساس توانایی تكثیر وقدرت كم كردن وزن و ایجاد مرگ ومیر « جدول 2وشكل 1 » ، ویروسهای H5N1 جدا شده به چهار گروه تقسیم شدند . هنگامی كه ویروس از هیچ ارگان موش 3 روز بعد از تلقیح با 6 10eID50 جدا نشد وهیچ كاهش وزنی ومرگ ومیری درموش مشاهده نشد ویروس در موش غیر پاتوژن محسوب می شود . ویروسهایی كه می توانستند درموش تكثیر كنند بیشتر به گروههای پاتوژنسیته كم (LD506.5Log 10 eID50 M ) ، متوسط ( 3log10eID50 MLD50 6.5log10eID50 ) یا زیاد ( MLD 3log10eID50) ، بر اساس قدرت كشندگیشان در موش تقسیم بندی می شدند . گروههای غیر پاتوژن دارای 7 ویروس ( شامل GSGD/1/96) بودند كه در موش تكثیر نمی كردند وباعث كاهش وزن نیز نمی شدند ، فقط یك ویروس ( DKGX/22/01 ) موجب تغییرات سرمی می شدند . گروه كم پاتوژن حاوی 4 ویروس بود كه با تیتر نسبتاً پایینی در ششها تكثیر می كردند، تمام این موشها تا روز 14 بعد از تلقیح دچار تغییرات سرمی شده بودند .
یك دوز بالا از این ویروسها ( eID50 بیشتر از 5.6 10 ) برای كشتن موش مورد نیاز بود تمام 7 ویروس درگروه با بیماریزائی متوسط در ششهای موش تكثیر پیدا كردند . سطح پایینی از دو ویروس درطحال تشخیص داده شد ویكی از ویروسهای جدا شده (DKSH/8/01 ) در سطح خیلی پائینی در مغز یافت شد . تمامی این ویروسها سبب عفونت كشنده درموش شدند اما دوز بالای ویروس ( eID50 6 10 تا 4 10 ) و طیف MLD50( از 407 تا ( 604log10eID50 مورد نیاز بود .
4 ویروس بسیار پاتوژن با تیتر بالائی در ششهای موش تكثیر می یابند و وجود ویروس در طحال ، كلیه ومغز دال بر عفونت سیستمیك می باشد . MLD50 ویروسها در این گروه كمتر از (203log10eID50 ) بود .
ما یك افزایش سطح پاتوژنسیته برای موش را با پیشرفت زمان مشاهده كردیم :
ویروسهای جدا شده در سال 1999 و 2000 برای موش كمتر بیماریزا بودند نسبت به آنهایی كه در سال 2000 و2002 جدا شدند ، اگر چه یكی از ویروسهای جدا شده در سال 2000 ( DKGD/40/00 ) در گروه با بیماریزائی متوسط قرار داشت ویكی از ویروسهای جدا شده درسال 2002 ( DKGX/53/02 ) دارای بیماریزایی كم بود

مطالعات در اردكها :

اردكهای وحشی میزبان طبیعی ویروسهای آنفولانزا هستند . تمام تحت تیپهای آنفولانزای مرغی از اردكهای وحشی جدا شده اند وهیچ یك از آنها كه شامل تحت تیپهای بسیار پاتوژن H5,H7 نیز می باشند وهیچ سابقه تاریخی دال بر ایجاد بروز علائم یا مرگ در اردكها ندارند .
بطور غیرمنتظره ، ویروسهای H5N1 جدا شده از مرغابی های وحشی در هنگ كنگ در نوامبر 2002 سبب بیماری شدید عصبی شد واردكها را هم درمزرعه وهم در آزمایشگاه كشت . ما گروههای 5 تایی اردكها را با 6 ویروس H5N1 كه نماینده ویروسهای مطالعه شده در این تحقیق می باشند شامل 3 ویروس از زیر گروه بسیار پاتوژن درموش تلقیح كردیم . « جدول 3 ». 5 تا از 6 ویروس H5N1 جدا شده در مرغابی هاهمانند سازی كردند . آنها دارای ریزش ویروسی از تراكه یا كلوآك در سطح 2.0-403log10eID50/ml بودند . ویروسها در اثر تماس پرندگان در ایزولاتور منتقل نشدند وهیچ یك از ویروسها سبب بروز علائم بیماری یا مرگ در اردكها نشد . .
بررسی ملكولی وفیلوژنتیكی : برای تعین اساس ملكولی مشاهداتمان ، تمامی ژنوم هریك از 21 ویروس جدا شده تعیین توالی شدند. توالی ها با توالی های نماینده H5N1 شامل آنهایی كه از GSGD/1/96 وانواع انسانی جدا شده از هنگ كنگ در سال 1997 HK/156/97 , HK/483/97 , HK/486/97 به دست آمده از بانك ژنی مقایسه شدند .توالی های هماگلوتینین HA ونورآمیند از NA مربوط به ویروس A/duck/Anyang/av – 1/01(H5N1) ( DK/AY/01 ) جدا شده از گوشت اردكهای صادراتی از چین به جنوب كره نیز مورد بررسی فیلوژنیكی قرار گرفتند . .
ژنهای NA ویروسهای H5N1 جدا شده از ویروسها بیشتر به ژنهای (GSGD/1/96 96.4-9803% همولوژی ) نزدیك بودند تا ویروسهای جدا شده HK/97 ازیك شاخه جداگانه با NA هایی می باشد كه ما از اردكها جدا كردیم . NA های ویروسهای جدا شده از اردكها به دو چنگال تقسیم می شدند كه DKGX/07/99 پایه وستون چنگال GSGD/1/96 , B1 پایه چنگال B2 می باشد . هر یك از این چنگالها حاوی ویروسهای جدا شده از 2000 تا 2002 می باشد. DK/AY/01 در چنگال از GSGD/1/96 مشتق می شود . بررسی توالی های آمینواسیدی بدست آمده نشان می دهد كه تمامی ویروسهای درچنگال كه از GSGD/1/96 مشتق می شوند دارای یك حذف 20 آمینواسیدی در ساقه NA هستند ( بنیان 49 تا 68 ) ، در حالی كه خود GSGD/1/96 این طور نیست . این حذف درساقه NA ، دارای فاصله اما هم پوشانی با حذف 19 آمینواسیدی یافت شد در ویروسهای HK/97 جدا شده از انسانها می باشد . ( بنیان های 54-72 ) . هیچ حذفی در ویروسهای NA در چنگال مشتق شده از DKGX/07/00 وجود ندارد.
درخت فیلوژی ژنهای PA,PB1,PB2 از 22 ویروس H5N1 خیلی شبیه بودند .
« شكل 2 ،‌c_e » . ویروسهای انسانی HK/97 جدا شده از یك شاخه مجزا بودند ، در حالی كه ویروسهای جدا شده از اردكها و GSGD/1/96 به دو چنگال اصلی كه در آن ویروسهایی كه جلوتر جداشده اند بطور غالب در یك شاخه هستند تقسیم بندی می شوند . در درخت فیلوژنی PB2 ، ژنهای دوچنگال در شاخه B سهم زیادی از همولوژی راداشتند ومتعلق به یك دودمان می باشند.
به بیان دیگر، چنگالهای B1,B2 ژنهای PB1.PA دارای 93-90% همولوژی بودند ومی توان آنها را به عنوان دودمان متفاوتی در نظر گرفت .
درخت فیلوژنیك «NP » نوكلئوپروتئین  متفاوت بود : ژنهای NP از 3 ویروس جدا شده از اردكها ( DKSH/35/02 , DKSH/38/01 , DKGX/50/01 ) یك شاخه جدا گانه را تشكیل می دهند ، درحالی كه HK/97 t NP انسانی یك چنگال را تشكیل می دهد ودیگر H5N1 های جدا شده چنگالهای چندتایی خواهر را كه با زمان یا محل جغرافیشان مطابقت نمی كند تشكیل می دهند . درخت فیلوژنیك M« ماتریكس » ژن دقیقاً مشابه با درخت ژنهای پلی مراز بود ، اما M ژنهای DKGD/40/00 , DKFJ/19/00 درچنگال متفاوتی در شاخه B كه خودش به باقی مانده ها ، شامل ویروسهای انسانی HK/97در آلل B مجزا می شدند  .
4 ویروس اردكی و GSGD/1/96 در آلل A قرار داشتند ، در حالی كه باقی مانده ها ، شامل ویروسهای انسانی hk/97كه خودش به دو شاخه تقسیم می شد قرار می گرفتند . در آلل B كه خودش به دو شاخه تقسیم می شد قرار می گرفتند . توالی های آمینواسیدی بدست آمده از تمام ویروسها درچنگال B1 از شاخه B درالل B دارای یك حذف 15-nt می باشد كه منجر به یك حذف 5 آمینو اسیدی در NS پروتئین می شود . «موقعیت 80 تا 84 » بر اساس تنوع ژنومیكی ، ویروسها 9 ژنوتیپ را تشكیل می دهند كه تكامل و ارتباطات درشكل 3 نشان داده شده است .
این مسئله كه ژنهای مشابه PB2,HA,NA در ژنوتیپ های متفاوت یافت می شوند قابل ملاحظه می باشد. اتصال وارتباط قوی بین ژنوتیپ ویافنوتیپ این ویروسها درموش وجود ندارد ، درحالی كه مسیرواضح از افزایش تصاعدی بیماریزایی این ویروسها در میان ژنوتیپهای مشابه ، بخصوص ویروسهای ژنوتیپ A,D دیده می شود .
DHSH/35/02 ,DKSH/38/01 در ژنوتیپ مشابه قرار دارند . « F » ، اما DKSH/35/02 3 10 بار كشنده تر از DKSH/38/01 در موش می باشد . بیماریزایی متفاوت دو ویروس در ژنوتیپهای گروهی H,I بیشتر از به ترتیب 105X ,106 X می باشد . این نتایج پیشنهاد می كند كه موتاسیونهای بخصوص بیشتر از ساختار ژنومی ممكن است قدرت بیماریزایی آنها را تعیین سازد .

بحث :

این مطالعه شرح می دهد كه قبلاً جدا سازی ویروسهای آنفولانزای H5N1 تعیین خصوصیت نشده از اردكهای منطقه mainland چین از GSGD/1/96(H5N1) گزارش شده اند.یافته های ما نشان می دهند كه ویروسهای آنفولانزای بسیار بیماریزا از اردكهای به ظاهر سالم در استان Coastal چین ( بین Shanghai , Guandong ) از سال 1999 تا 2002 جدا شدند . این ویروس H5N1 جدا شده واكنش آنتی سرمی مشابه داشتند وژنهای HA آنها از نظر فیلوژنیكی هموژنوس بود . تمامی آنها به جز یكی سبب عفونت كشنده و وسیع سیستماتیك در جوجه ها می شدند و همگی دارای یك ردیف هایی از آمینواسیدهای پایه در محل برش HA بودند كه با بیماریزائی بالا همراه بود.
یافته های ما مشخص كرد كه ویروسهای آنفولانزای H5N1 درمیان اردكهای اهلی در چین از 1999 تا 2002 كه درچرخش هستند قادر به تكثیر در موش بوده و سبب عفونت سیستماتیك ومرگ بدون سازگار شدن در موش می شوند .
تعدادی از محققین گزارش كرده اند كه ویروسهای H5N1 جدا شده از انسان برای موش كشنده هستند .
فاكتورهایی زیادی گزارش شده اند كه با بیماریزائی H5N1 همراه می باشند. مطالعات معكوس ژنتیكی نشان داده كه بنیان 627 پروتئین PB2 یك نقش حیاتی در بیماریزائی H5N1 در موش دارد ، همانطور كه داشتن ردیفهایی از آمینو اسیدهای اساسی در محل برش HA همین نقش را دارد . مطالعات دیگر نقش ژن NSوتوانائیش درتعدیل پاسخ سیتوكاینی را بازگو می كند. مطالعات معكوس ژنتیكی نشان داده اند كه بان 92 از ملكول NS1 از نمونه های ویروسهای (H5N1) A/HK/156/97 انسانی با القاء بیماریزائی شدید در خوكها همراه می باشد. لیكن ، تمامی ویروسهای H5N1 اردكی دارای بنیان های آمینو اسیدی حفاظت شده GLV-627 در PB2,ASP-92,GLY-228 ( اعضای H3) در محل باند شدن بارسپتور می باشند . بنابراین ، این بنیانها ممكن است كه در همانند سازی های متفاوت وبیماریزائی ویروسهای H5N1 اردكی در موش شركت نكنند . سوال مهمی كه باقی می ماند این است كه چگونه و چه وقت ویروسهای H5N1 توانایی تكثیر پستانداران را پیدا كردند .
نتایج ما نشان می دهد كه همانطور كه ویروسهای H5N1 در میان اردكهای اهلی در چرخش هستند ، خصوصیاتی درانها پدید می آید كه می توانند برای موش كشنده باشند. یك شرح احتمالی برای این یافته ها انتقال ویروسهای H5N1 از اردك به انسانها ، تكامل انتخابی ویروسها در انسان ها ومتعاقباً انتقال دوباره آنها به اردك می باشد . شواهد محدود سرولوژیكی از عفونت زایی H5N1 انسانی وجود دارد همچنین شواهد محدودی نیز درباره انتقال فرد به فرد ویروسهای H5N1 وجود دارد . شواهد در دسترس پیشنهاد می كند كه از سال 1997 ، ویروسهای آنفولانزای آسیایی باعث عفونتهای محدود كشنده یا حاد در انسانها می شوند ، اما از انسان به انسان منتقل نمی شوند . انتقال بازگشتی ویروسها را از انسانها به اردكها را به سختی می توان اثبات كرد ، علی رغم وجود شواهدی كه در مورد انتقال ویروسهای آنفولانزای مرغی H9N2 از اردكها به دیگر طیور و سپس برگشت آنها به اردكها وجود دارد.
مسئله اساس ملكولی ویروسهای قابل انتقال به پستانداران حل نشده است . بطورعمده ژنهای چندتایی ویروسی ، شامل HA دخیل هستند . تعدادی ساختارهای ژنهای مرغی چنین فرض می شود كه باعث انتقال به پستانداران می شوند. ویروسهای آنفولانزای H3N2كه درخوكها در سال 1997 در ایالت متحده وجود داشته اند نوترتیبهای 3 تایی بودند كه حاوی قطعات ژنی از ویروسهای آنفولانزای مرغی ، انسانی وخوكی بودند. این ویروسهای نوترتیب 3تایی H3N2 درمیان خوكها به میزان بسیار بالایی منتقل می شوند و در ایالت متحده انتشار وسیعی پیدا كردند .
به طور مشابه ، ویروسهای آنفولانزای خوكی H1N1 كه بطور رایج در اروپا دارای انتشار وسیع هستند حاوی ژنهای ویروسهای آنفولانزای مرغی كه در سال 1999 یافت شدند می باشند . در نتیجه ، ژنهای ویروس آنفولانزای مرغی ، وقتی كه آنها قسمت عمده ای از ساختار ژنی باشند ، به نظر می رسد كه بتوانند در میان گونه های پستانداران منتقل شوند . ارزیابی ژنوتیپهای مختلف ویروسهای H5N1 در اردكها ممكن است ساختار ژنهایی را كه سبب انتقال به پستانداران می شوند روشن سازد . احتمالات متفاوتی در مورد انتخاب خوك بعنوان میزبان وجود دارد .« وجود یك میزبان واسط » . در ناحیه ای از چین كه ویروسهای H5N1 آنها در این مطالعه تعیین خصوصیت شدند ، خوكها واردكها در كنار یكدیگر نگهداری می شوند خصوصاً در مزارع روستایی كه خانواده ها دارای تعداد كمی خوك واردك هستند . فرضیه كار ما این است كه ویروسهای H5N1 بتدریج توانایی تكثیر در پستانداران را از طریق انتخابی كه تحت فشار رخ می دهد وهمچنین احتمال انتقال بین خوكها واردكها پیدا می كنند . امروزه ، هیچ گزارشی از جداسازی ویروسهای H5N1 از خوكها وجود ندارد ، اگر چه خوكها بطور آزمایشگاهی باویروسهای H5N1 عفونی شده اند . ما اخیراً شواهد ویروس شناسی وسرولوژیكی از عفونت زائی ویروس H5N1 در خوكها دراستان Fvjian بدست آوردیم .

مقدمه :

ویروس آنفولانزای مرغی FPV Rostock بر روی سلولهای L موش پلاك تشكیل نمی دهد .طیف میزبانی ویروس موتانت FPV Doboson یك ویروس كه بطور نزدیكی FPV Doboson مرتبط می باشد بوسیله پاساژهای مكرر در انواع سلولهای پستانداران شامل سلولهای L ,Hela ,BHK انتخاب شد . این ویروس ، كه بعنوان Dobson 4H شناخته شده ، پلاك های شفاف در سلولهای L تشكیل می دهد . كارهای قبلی با ویروسهای نوترتیب نشان می دهد كه فنوتیپ تشكیل دهنده پلاك بوسیله قطعه 1RNA كه تحت واحد PB2 از كمپلكس پلی مرازی ویروسی راكد می كند پدید می آید . ما در حال تلاش برای فهم اساس ملكلولی این محدود شدن طیف میزبان هستیم چرا كه ممكن است سر نخ های مهمی را در مورد وقایعی كه انتقال ژنوتیك ویروسهای آنفولانزای مرغی را به مزبانهای پستانداری افزایش می دهد به ما دهد

بحث :

دلیل اینكه چرا تغییرات در پروتئین PB2 ممكن است سبب از دست دادن توانایی تشكیل پلاك بر روی رده سلولی پستانداران می شود هنوز روشن نشده است . PB2 یك بخش محلق شونده به كمپلكس پلی مرازی است . SHIH ,Krug پیشنهاد كردند كه باند شدن پلی مراز ویروسی با پروموتورتاخیری درعفونت ممكن است چنگال همانند سازی را تنظیم كند وهمچنین نشان داده اند كه چنگال همانند سازی بستگی به پروتئین های سلول میزبان دارد .
این مسئله كه تغییر در توالی های PB2 اثر می گذارد بر روی تمایل كمپلكس پلی مرازی برای اینكه RNA بتواند نقص در تنظیم چنگال را در سلولهایی كه فاقد یا دچار كمبود درفاكتورهای عمده سلول میزبان هستند جبران كندقابل درك می باشد.
همبستگی آنتی ژنتیك بین نورآمینیداز A/H5N1 وآنفولانزای پاندمیك 1918 پاندمیك های A/H5N1 ما را بر آن داشت كه وضعیت سرولوژیكی جمعیت های فرانسوی را در مقابل سویه A/HK/156/97 بررسی كنیم .

بحث :

مشاهدات هنگامی انجام گرفت كه 198 سرم فاقد آنتی بادی های anti-A/HK/145/97 HI در تست NIدر مقابل ویروس A/HK گزارش شد وسپس هنگام بررسی به عنوان یك فعالیت بر روی گروههای سنی ، ما ابتدا اساس كارمان را بر روی افرادی كه دارای ملاقات با سویه های پاندمیك 1918 ویا 1934 بودند گذاردیم . درواقع ، یك طیف غیر منتظره بالا از شیوع آنتی بادی های anti-A/HK NI در سرمهای افرادی با دو محدوده سنی 75-95 و 98-76 مشاهده شد در حالی كه یك شیوع خیلی پائینی در اشخاص زیر 59 سال دیده شد . شباهت نزدكی بین شیوع سنی پروفیل آنتی بادی های anti-A/HK NI و anti-A/HK نزدیكی ارتباط آنتی ژنیك را بین NA این دو ویروس پیشنهاد می كند .
سرمهای متعدد انسانی مشاهده شده كه قادر به خنثی سازی عفونت زائی ویروس A/HK در محیط آزمایش هستند ، بطور عمده سرمهایی كه متعلق به افراد با گروه سنی 98-76 سال می باشند . همچنین متعاقباً شیوع آنتی بادی NT بسیار مرتبط با شیوع آنتی بادی NI در این گروه می باشد ( anti A/HK , anti-A/PR8 ) برعكس آن چیزی كه درگروه سنی 60 تا75 سال مشاهده شد .
از این اطلاعات می توان دلائل منطقی برای فرضیه های زیر آورد :
در گروه سنی 60 تا75 سال ، وجود قبلی آنتی بادی های NI احتمالا در اثر تماس مستقیم با ویروس A/PR8 می باشد ، قادر بود كه فعالیت آنزیماتیك ویروس A/HK ممانعت به عمل آورد اما نمی تواند اثر خنثی كنندگی بر روی عفونت زائی ویروس داشته باشد .
در گروه سنی 76 تا98 وجود قبلی آنتی بادی های NI احتمالا به دلیل تماس مستقیم با سویه پاندمیك 1918 قادر است از فعالیت آنزیماتیك هر دو سویه A/PR8 , A/HK جلوگیری می كند وهمچنین می تواند از اثر خنثی كننده بر روی ویروس A/HK داشته باشد .
دراین مطالعه ، حذف نقش احتمالی آنتی بادی های anti-HA ما را قادر می سازد كه راه احتمالی نقش حفاظت كنندگی آنتی بادی های ضد NA را بوسیله نشان دادن قدرت خنثی سازی بعدی ها پیدا كنیم .
اطلاعات ما دلایل سرولوژیكی برای نزدكی ارتباط بین NA از A/HK وسویه H1N1 كه در پاندمی 1918 جدا شد می آورد . چنین همبستگی آنتی ژنیكی بین این دو نورآمیینداز با اطلاعاتی كه مادرباره توالی های نوكلئوتیدی آنها داریم سازگار می باشد . بعلاوه ، yuen وهمكارانش در سال 1998 و Glass وهمكارانش در سال 1998 پیشنهاد كردند كه ویروس H1N1 مسئول پاندمیك انسانی مه 1918 باعث داخث شدن مستقیم ویروس آنفولانزا به جمعیت انسان بوده است .

قسمت دوم : پاتوژنزیس ، ویرولانس و ایمنی

تغییرات ساختمانی هماگلوتینین ویروس آنفولانزا كه بیماریزایی راتحت تاثیر قرار می دهد .
هماگلوتین ویروس انفولانزای مرغی (AI) به نظر می رسد كه دارای این خصوصیت منحصر به فرد است كه آمینواسیدهای بازیك رادر جایگاه برش پرتئولتیك خود قبول می كند (PCS ) . همراه بودن امینواسیدهای چندتایی بازیك با انتشار بافتی و بیماریزائی توسط سویه های AI اولین بار توسط Klen K, Rott, orlich ودیگران در اواخر 1970 پیشنهاد شد وبرای دو دهه همچنان حفظ شده است . در حالی كه دیگر خصوصیات ساختمانی و دیگر ژنهای نیز می توانند بطور عمده بیماریزایی را تحت تاثیر قرار دهند ، وجود آمینواسیدهای چندتایی بازی در pcs یك ساختمان نشان دار را پدید می آورد كه ادامه بررسی توالی های سویه های AIجدا شده از مزارع را توجیه می كند .
بعلاوه ، با این شمای ساختمانی نوك HA را مستعد نمایان و پنهان كردن محل های گلیكوز یلاسیون می كند ، كه تعدادی از انها با بیماریزایی همراه هستند.
برای مثال، درآزمایشگاه ما نشان داده شده كه وجود كربوهیدراتها نزدیك به محل باند شدن بارسپتور ( RBS) یك ویروس جدا شده AI از نوع H7 با افزایش بیماریزائی در جوجه ها همراه بود .
ویروسهای H5N1 كه در سال 1997 در هنگ كنگ ظاهر شدند از دو نظر منحصربه فرد بودند هم از نظر ساختمان پروتئین HA شان وهم از نظر پاتولوژی در حیوانات . این ویروسهای مرغی حاوی آمینواسیدهای بازی چندتایی درمحل برش بودند ویك محل اضافه شدن كربوهیدرات قابل موتاسیون در قسمت نوك محل باند شدن بارسپتور . آنها بسیار در جوجه ها كشنده بودند اما برخلاف دیگر سویه های شدیداً بیماریزایی AI آنها برای موش نیز كشنده بودند . پس این ویروسها یك مدل ایده آل برای مطالعه شمای ساختمانی HA ویروسهای بسیار پاتوژن را فراهم می آورند .
تعیین خصوصیات یك ( Alty/Eng/87-92/91) H5N1 جدا شده كه دارای آمینواسیدهای باز یك چند تایی درمحل برس HA می باشد .
دو ویروس H5N1 از فقط یك اردك طی شیوع آنفولانزای مرغی شدید (HPAI) در Norfolk انگلیس درسال 1991 جدا شد . یكی كه (A/ty/Eng/50-92/91 ) برای طیور اهلی خیلی بیماریزا بود دارای اسیدآمینه های چندتایی باز یك در محل برش HA بود و بخوبی درسلولهای MDCK بدون اضافه كردن تریپسین رشد می كرد كه از خصوصیات تیپیك ویروسهای ( HPAI) می باشد .
دیگری (A/ty/Eng/87-92/91 ) دارای محل برش مشابه بود اما بیماریزانبوده وبر روی سلولهای MDCK حتی با اضافه كردن تریپسین رشد نمی كرد . دو ویروس جدا شده هیچ فرقی از نظر ژن HAكه با بیماریزائی آنها مرتبط است نداشتند . این مطالعه بر روی رشد و خصوصیات ملكولی پاساژ یك رقت محدود كلون ( A/ty/Eng/87-92/91) می باشد . 

بحث :

ویروس (A/ty/Eng/87-92/91) H5N1از مغز یك اردك كه دراثر HPAI مرده بود جدا شد . لیكن ، كلون LDP3 بدست آمده از این ویروس قادر نبود كه در بدن منتشر شود یا درمغز جوجه هاواردك ها تكثیر پیدا كند همانطور كه درمورد ویروسی با آمینو اسیدهای باز یك چندتایی در محل برش انتظار می رود . پاساژ در جنین 14 روزه تخم مرغابی براحتی موتاسیونهایی را از كلونهای غیر بیماریزای LDP3 از A/ty/Eng/87-92 كه می توانست در سلولهای MDCK درغیاب تریپسین رشد كند انتخاب كرد .
این موضوع مخالف با پاساژ LDP3 در جوجه ها یا جنین 10 تا 11 روزه تخم مرغابی بود كه در تولید موتانت هایی كه بتوانند در MDCK رشد كنند . این افزایش بیماریزائی لیكن ، به بیماریزائی در جوجه ها ترجمه نمی شود ، كلون G30 یك IVPI از تغییرات O.NO به نظر می رسد در توالی های نوكلئوتیدی HA وابسته به ویروس والد LDP3 می باشد و بنابراین فشار انتخابی ، باعث توانایی رشد موتانت های B22,G33 در سلولهای MDCK شده بایستی در جای دیگری از ژنوم قرار گیرد .
آزمایشات نوترتیبی منجر به این حدس شد كه ژنهای ماتریكس و PB2ممكن است كه درتعدیل پاتوژنسیته نقش داشته باشند . بنابراین ژن كامل PB2 برای كلون های 2L G33,LDP3 توالی نوكلئوتیدی بودند كه بطور روشن 3 تغییر آمینو اسیدی از آن استنتاج شد كه به نظر می رسید با بیماریزایی مرتبط باشد . لیكن ، تعیین توالی نسبی كلونهای 87V , 5L نشان داد كه ارتباطی بین تغییرات آمینو اسیدی استنتاج شده و IVPI وجود ندارد .
اخیراً ، پیشنهاد شده است كه گلیكوزیلاسیون اضافی HA همراه با یك ساقه كوتاه NA خصوصیات ویروسهای مرغی H7 , H5 می باشد . جالب اینكه ژنهای NA از A/ty/Eng/50-92/929 . LDP3 دارای یك حذف پیش بینی شده 23 آمینو اسیدی در مقایسه با A/parrot/NI/73 می باشد . لیكن هیچ یك از این ویروسهای جدا شده دارای محلهای گلیكولیزاسیون اضافی بر روی HA نبودند پس یك استثناء را برای این نقش پدید می آورد .« 7 ، صفحه 15 »
روش ژنتیك معكوس نشان می دهد كه رشد ویروس آنفولانزا بوسیله گلیكوزیلاسیون هماگلوتینین تنظیم می گردد .
عفونت ویروس آنفولانزا بوسیله باند شدن ذره ویروسی با رسپتورهای اسید سیالیكی بر روی سطح سلول میزبان آغاز می شود . این عمل باند شدن توسط گلیكوپروتئین HA انجام می شود . منطقه ای از HA كه با رسپتور باند می شود نشان داده شده كه یك پاكتی از آمینو اسیدها در منطقه مسئول باند شدن دخیل می باشند . در HA ویروس طاعون مرغابی ها ( A/FPV/Rostock/34 ) این پاكت باند شونده در طرفین خوددارای دو زنجیره جانبی الیگو ساكارید N-Linked می باشد . در مطالعات قبلی كه درآن موتانتهای FPV-HA فاقد هر یك « موتانت G1,G2» یا دو « موتانت G1,2 » محلهای ژنهای گلیكوزیلاسیون بودند كه به كمك یك وكتور SV40 بیان شدما نشان دادیم كه این گلیكان ها تمایل باند شدن رسپتور را تعدیل می كنند.
دراین مطالعه ما بر روی این موضوع كه چگونه این تخلیه گلیكانی بر روی رشد ویروس اثر می گذارد وقتی كه HA موتاسیون یافته به طور پایدار از طریق یك روش ژنتیك معكوس به ویروسهای نوتركیب اضافه شود كار كردیم .
در این سیستم یك قطعه HA موتاسیون یافته شبه ویروس آنفولانزا در هسته سلولهای عفونی شده بوسیله RNA پلی مراز I سلولی از یك حامل پلاسمیدی نسخه برداری شد . بر اساس عفونت سلولها با یك ویروس كمكی مناسب قطعات موتاسیون یافته HA با ویریونهای پروژنی تركیب می شوند .
دو ویروس نوترتیب A/WSN/33 بعنوان ویروسهای كمكی برای بوجود آوردن دو سری از ویروسهای نوتركیب موتانت HA مورد استفاده قرار گرفتند كه فقط در NA كه حمل می كنند فرق می كنند به ترتیب تحت تیپ های N1 یا N2 .
دراینجا ما نشان دادیم كه فقدان یكی « موتانت G2» یا دوتا « موتانت G1,2 » گلیكان دارای اثر شدیدی بر روی رشد ویروسهای حاوی N1-NA اثر دارد كه بطور عمده سبب آزادسازی یك ویروس پروژنی ترمیم نیافته از سلولهای عفونی می شود.
برای ویروسهای N2-NA چنین محدودیت های رشدی باموتانت G2 قابل تشخیص نیست با موتانت G1,2 كمتر ظاهر می شود . نتایج ما دلالت بر این می كند كه بر هم كنش بین محل باند شدن رسپتور والیگوساكاریدهای مجاور HA برای توانایی رشد ویروسهای آنفولانزا درسلولهای میزبان تعیین كننده می باشد .

بحث :

بوسیله برداشت پشت سر م زنجیرهای جانبی الیگوساكاریدی از نوك ملكول HA ما نشان دادیم كه فعالیت باندشدن رسپتور بتدریج بوسیله این گلیكانها تنظیم می گردد. بعلاوه ، این تنظیم باند شدن رسپتور بسیار وابسته به طبیعت جفت شدن NA ویروس است .
از آْنجایی كه اخیراً شرح داده شده كه گلیكوزیلاسیون HA وتحت تیپ NA یك نقش قطعی را در تعیین طیف میزبانی وسازگاری با میزبانهای جدید ویروسهای آنفولانزا دارد ما مراحل دستكاری اختصاصی این اعمال را به منظور ساخت یك ویروس یا خصوصیات رشد شناخته شده تعیین كردیم .
در نتیجه ، روش ژنتیك معكوس ما یك ابزار آزمایشگاهی عالی را برای مطالعه بر هم كشش وجفت شدن انواع مختلف HA,NA تولید ویروسهای آنفولانزا با توانایی تنظیم دقیق فعالیت باند شدن با رسپتور فراهم كرده است . 
M1 پروتئین ویروس آنفولانزای A با PACK1 « رسپتور Cكنیاز فعال » انسانی تداخل پیدا می كند .
ویروسهای آنفولانزا اعمال سلول میزبانی را دستكاری كرده ودر اختیار خود می گیرند . ما علاقمند به شناسایی فاكتورهای سلولی كه بوسیله برهم كنش پروتئین – پروئین هدف ویروس قرار می گیرند هستیم .
ما قبلاً پروتئین هایی را كه با پروتئین NS1 ویروسی تداخل دارند شناسایی كرده ایم و این مطالعات را بر روی پروتئین M1 ماتریكس از ویروس آنفولانزای A توسعه داده ایم گزارش شده كه m1 پروتین هم نقش ساختمانی وهم نقش تنظیمی در سر هم بندی شدن ونشدن ویروس و تنظیم نسخه برداری RNA وانتقال داخل سلولی قطعات RNP ژنومیك دارد . بعلاوه ، M1 پروتئین های تحت تیپهای A,B,C روشن شده كه بر روی بنیان ترئونین وسرین در سلولهای عفونی فسفریله شود . فسفریلاسیون قابل ملاحظه M1 پروتئین ومطابقت كینازها هنوز تعیین نشده است . ما فرض كردیم كه یكی یا بیشتر ازخصوصیات M1 پروتئین بوسیله تداخلها با فاكتورهای ناشناخته سلولی تعیین می گردد. به منظور شناسایی چنین تركیبات سلولی ، ما از سیستم مخمر دوهیبدریدی با پروتئین M بعنوان یك طعمه استفاده كردیم .
بعنوان یك نتیجه ، ما 4 كلون CDNA غیر وابسته را جدا كردیم كه بطور اختصاصی با M1 پروتئین در سیستم دوهیبریدی مخمر تداخل داشت و با پروتئین بسیار حفاظت شده ( receptor of activated ) RACK1 بر هم كنش دارد .
RACK1 قبلاً پیشنهاد شده كه بعنوان یك پروتئین رسپتور داخل سلولی برای فعال شدن پروتئین كنیاز C(PKC) عمل می كند . ما بر روی نقش احتمالی تداخل بین M1-RACK1 برای فسفریلاسیون M1 پروتئین بحث كردیم . ( 7 ، صفحه 18)

بحث ونتایج :

ما از M1 پروتئین بعنوان یك طعمه در سیستم دوهیبریدی مخمر برای جستجوی یك كتابخانه CDNA بیان شونده برای فاكتورهای تداخلی استفاده كردیم . 4 ، CDNA با پروتئین RACK1 انسانی كه بطور اختصاصی با M1 پروتیین جدا شده باند می شدند مطابقت می كردند . بر هم كنش ژنتیكی بوسیله با هم رسوب دادن اختصاصی M1 پروتین از عصاره سلولهای عفونی با ویروس با استفاده از یك فیوژن پروتئین GST-PACK1 در روش GST-Pull down تایید شد.
PACK1 یك پروتئین 36 كیلو دالتونی بسیار حفاظت شده است كه حاوی 7 دمین WD40 دارای انواع مختلفی از پروتئین های تنظیمی هستند و واسطه تداخل پروتئین یا پروتئین هستد . PACK1 پیشنهاد شد ه كه بعنوان یك پروتئین رسپتور داخل سلولی كه به فرم فعال PCK در غشاء ها یا تركیبات اسكلت سلولی متصل می گردد .
با توجه به تداخل M1-PACK1 ما سردرگم شدیم اگر كه PCK بتواند فسفریلاسیون M1 پروتئین را وساطت كند . ما توانستیم نشان دهیم كه پروتئین نوتركیب M1 بوسیله PKC خالص در محیط آزمایشگاه فسفریله می شود . M1 پروتئین بوسیله PKC فسفریله می شود در طول عفونت ویروسی .
این یافته ها ممكن است دلالت بر این كند كه عمل تداخل M1-PACK1 طی فسفریلاسیون M1 پروتئین انجام می گیرد . تغییرات ژنتیكی درحساسیت نسبت به Zanamivir در تكثیر invitro كه بطور طبیعی در ویروسهای آنفولانزای مرغی رخ می دهد .

آنالوگ سیالیك اسید به نام Zanamivir

( 4-guanidino -2,4 – dideoxy -2,3 – dehydro –N-acetyneuraminic acid )
یك ممانعت كننده باتمایل واختصاصیت بالا از باند شدن طبیعی NA از ویروسهای آنفولانزای A,B می باشد. واریانت های مقاوم به Zanamivir ، كه دارای موتاسیون در NA ویا HA هستندبه وسیله پاساژهای مكرر در حضور دارودر كشت بافت جدا شده اند . ما قبلا نشان دادیم كه ویروسهای آنفولانزای معمول تغییراتی را در حساسیت همانند سازیشان نسبت به زانامیویر در كشت بافت نشان می دهند .
ویروس A/DUCK/Ireland/113/83 H5N8 « ویروس اردكی ایرلندی » بسیار حساس می باشد ، A/FPV/Egypt/45 H7N1 « Egyt» ، A/FPV/England/1/63 H7N3 ( Langham ) حساسیت متوسط و « یك ویروس نوترتیب كه دارای HA,NAاز A/FPV/Kostack /34(H7N1) SD17 نسبتا مقاوم می باشد .
لیكن ، برای هر 4 ویروس ، فعالیت NA بوسیله زانامیویرممانعت می شود ، در حالی كه فعالیت هماگلوتیناسیونی نسبتا به زانامیویر حساس می باشد.
ویروسهای نوترتیبی كه از این 4 ویروس حاصله شده است ، به منظور شناسایی ژنهایی كه درتغییر حساسیت نسبت به زانامیویر در in vitro وبرای شناخت مكانیسمی كه این ژنها بر روی حساسیت تاثیر می گذارند مورد مطالعه قرار گرفته است .
این اطلاعات را می توان برای پیش بینی خصوصیات ویروسهای پاندمیك های جدید آنفولانزا درانسانها كه ممكن است دراثر استفاده گسترده از داروی زانامیویز پدید آیند استفاده كرد

بحث :

حساسیت های متفاوتی كه نسبت به داروی زانامیویر در محیط كشت بافت وجوددارد را می توان بر اساس خصوصیات NA,HA آنها شرح داد .
ما پیشنهاد می كنیم كه باند سیالیك اسید با موقعیت 158 از SD17 ممكن است پاكت باند شونده رسپتور را پر كند ، وبا سیالیك اسید برای چسبیدن به رسپتورهای سلولی ویا ذره ویروسی رقابت كند .
در نتیجه ، ویروسهایی كه دارای این HA هستند می توانند با جدا شدن ازرسپتورها با كاهش وابستگی به فعالیت NA ودر كشت بافت كمتر به زیناویر حساس باشند. NA با ساقه بلند در آزاد سازی ویروس از رسپتورها كار آمدتر است تاNA یی كه دارای ساقه كوتاه می باشد ، همچنین NA هایی كه دارای ساقه بلند هستند می توانند بطور كارآمد از رسپتورها درغیاب زانامیویر آزاد شوند لیكن ، به دلیل اینكه ساقه بلند NA نقش بیشتری را درآزاد سازی ویروس از سلولها نسبت به NA با ساقه كوتاه ایفا می كند ویروسهای با NA ساقه بلند نسبت به زانامیویر دركشت بافت حساس تر می باشند . ( 7 ، صفحه 23)

سیتوكاین ها در پاتوژنزیس آنفولانزا :

خصوصیات یك آنفولانزای بدون عوارض جانبی در انسان وحیوانات بوسیله شروع ناگهانی تب ، لرز ، در عضله وعلائم تنفسی می باشد .سلول هدف برای ویروس سلولهای اپی تلیال در طول كل دستگاه تنفس می باشد ، اما الگوی عفونت ودرگیر شدن قسمت پایینی دستگاه تنفس به نظر می رسد كه در حیوانات مختلف فرق می كند . مطالعات هیستولوژیك قسمت بالایی دستگاه تنفس ویا ششها بطور تیپك نكروز سلولهای اپی تلیال و انفیلتراسیون نوتروفیلی رانشان می دهد . علی رغم توضیحات زیاد كلینكی وپاتولوژیك ، علت علائم بیماری و پاتولوژیكی هنوز كشف نشده باقی مانده .اما شواهد رو به رشدی دل بر اینكه تولید اولیه سیتوكاین درمحل عفونت نقش در ایجاد التهاب وعلائم دارد در دست می باشد . از میان این سیتوكاین ها می توان به اینترفرون ( IFN- ) ، فاكتور نكروز دهنده تومور ( TNF-) ، اینترلوكین 1 و اینترلوكین 6 وتعدادی كموكاین اشاره كرد .
این مرور بر روی تعدادی از نشانه هایی كه سیتوكاین ها طی آنفولانزا در انسان وخوك :
سینتیك تعدادی از سیتوكاین ها طی عفونتهای تجربی آنفولانزا درانسان وخوك مورد مطالعه قرار گرفته است . در انسان تهوع ، بیماری سیتسمیك ودرگیری قسمت بالای دستگاه تنفس غالب می باشد . در طول دوره حداكثر بروز علائم IFN- , IL-6 , TNF- , IL-8 در ترشحات بینی یافت شده است .
IFN- و IL- ارتباط مستقیم با تیتر ویروس وشدت بیماری دارند. دیگر سیتوكاین ها مانند IL-1B,IL-2 ,TGF-B دیده نشده كه بطور قابل ملاحظه ای افزایش پیدا كنند .
با استفاده از خوكهای gnotobiotic ، یك مدل تجربی برای ایجاد آنفولانزای خوكی برای محققین آزمایشگاهی فراهم آمد . علائم تیپیك كلینیكی وپاتولوژی شامل تب ، عدم تعادل، افسردگی ، تنگی نفس شدید و یك برونكوپنومونیای نكروزیش
می باشد . سطح بالای IL-1 ,TNF- , IFN- در مایع برونشهای آلوئولار یك روز بعد از عفونت دیده می شود . وقتی كه غلظت سیتوكاین ، تیترهای ویروس در شش وشمارش نوتروفیل در BAL مقایسه گردید ، یك ارتباط مستقیم بین هر سه وجودداشت .
بعلاوه بالا و پایین رفتن تولید سیتوكاین دقیقا با علائم كلینیكی مرتبط است .

القاء سیتوكاینی در سطح سلولی :

مكانیسمهای القاء سیتوكاین بوسیله ویروس آنفولانزا هنوز كاملا روشن نشده است و هنوز جوابی برای سوالی همچون : آیا تولید سیتوكاین در سلولهای عفونی صورت می گیرد یا دیگر سلولها ؟
كدامیك از پروتئنها یا ژنهای ویروسی دخیل هستند ؟ آیا مكانیسمهای القاء برای سیتوكاین های مختلف متفاوت می باشد ؟
تعدادی مطالعات TNF- ,IFN_ in vitro داده های متضادی را نشان داده است . تعداد سیتوكاین قویاً وابسته به نوع سلول می باشد واستفاده از انواع مختلف سلول ممكن است توجیه كننده این مغایرتها در مطالعات in vitro باشد . تاكنون سلولهای تولید كننده سیتوكاین در in vitro طی بیماری آنفولانزا تعیین مشخصات نشده اند.
بنابراین ، ما منشا سلولی TNF- , IFN- در شش خوكهای عفونی شده را بررسی كردیم . 

شواهد بیشتر در مورد نقش سیتوكاین ها در آنفولانزا :

سیتوكاین ها بخشی از یك شبكه پیچیده هستند وتعیین نقش سیتوكاین های اختصاصی در in vitro مشكل می باشد ، دراینجا هم مطالعات آزمایشگاهی با استفادهاز راههای مختلف وانواع حیوانات نتایج متضادی را داد . این مطالعات میزان قابل توجه IL-1B,IL-1 , TNF- , IFN- در پاتوژنز آنفولانزا تایید كرد. لیكن ، اثر بلوك كردن سیتوكاین های اختصاصی فقط تا حدودی بود ودر تعدادی موارد خیلی خفیف بود . مطالعات در موش صحرائی به عبارت دیگر در پیدا كردن شواهدی برای نقش IL-1 . IL-6 , TNF- در القاء تب در آنفولانزا به نتیجه نرسید

بررسی فاكتورهای TGF-B ومرگ سلولی در پاتوژنز ویروس Hong Kong /156در جوجه ها :

سویه های بیماریزای ویروس آنفولانزابطور شدید باعث خسارات اقتصادی به صنعت جهانی طیور می گردد. بسیاری از مطالعات دقیق مقایسه ای نشان می دهد كه در سویه های انسانی ومرغی هنگ كنگی كه شناسایی شده اند انتقال متقاطع گونه ای مستقیما با تغییرات ژنهای ویروسی مرتبط نمی باشد .
اگر چه اطلاعات زیادی در مورد ویروسهای آنفولانزا در دست می باشد ولی در مورد پاتوژنز ویروس هنوز داشته های ما خیلی كم می باشد .
مطالعات با استفاده از سویه بسیار پاتوژنA/Turkey/Ontario/7732/66cty/ont پیشنهاد می كنند كه كم شدن لنفوسیتها كه درجوجه ای عفونی مشاهده می شود یك نتیجه مستقیم آپوتوزیس می باشد . كارهای بیشتر نشان می دهد كه TGF-B ، یك پروتئین بسیار حفاظت شده تنظیم كننده رشد ، مستقیما بوسیله ویروس آنفولانزا فعال می شود وآپوپتوزیس را القاء می كند .
افزایش فعالیت TGF-Bدر 8 ساعت بعد از عفونی كردن جوجه ها با TY/ont مشاهده شد . جالب است كه ، جوجه هایی كه با غلظت معادل از A/Mallard/Wisconsin یك سویه كم پاتوژن ، عفونی شدند افزایشی در فعالیت TGF-B را نشان ندادند وسطح آپوتوزیس خیلی پایین بود .

بحث :

در این مطالعات ما نشان دادیم كه ویروس 156 هنگ كنگی ابتدا در اپیتلیوم دستگاه تنفس همانند سازی می كند و به دنبال آن به سرعت در بدن پخش می شود . افزایش آپوپتوزیس به نظر می رسد كه درابتدای عفونت رخ می دهد وبا گذشت زمان افزایش
می یابد.برخلاف دیگر سویه بسیار پاتوژن آنفولانزای مرغی ، HK156 قادر نیست كه TGF-B را فعال كند . دلیل این مسئله نامعلوم است .
پاسخ های ایمنی سلولی وهمورال خوك به یك عفونت با ویروس آنفولانزا یا بعد از واكسیناسیون خوكها بر علیه آنفولانزا بطور رایج بوسیله دو دفعه به روش داخل ماهیچه ای با استفاده از یك واكسن غیر فعال ویروس كامل ، حاوی آدجوانت صورت می گیرد . همچنین یك واكسن تیترهای بالای آنتی بادی IgG را در خون القاء می كند ومی تواند نقش حفاظتی در برابر بروز علائم بیماری داشته باشد . اما محافظت در برابر یك عفونت وسویه های مختلف از نظر آنتی ژنتیكی از تحت تیپهای مشابه هنوز بصورت سوال باقی مانده است . ما باور داریم كه یك دستور كار واكسیناسیون كه بیشتر یك پاسخ ایمنی ماهیچه ای و ایمنی سلولی را تحریك می كند . مصونیت بهتری بوجود می آورد . بنابراین ، ما شروع به مطالعه مقایسه ای بین پاسخ های ایمنی بعد از یك عفونت طبیعی و واكسیناسیون كردیم .

بحث :

نتایج دل بر یك ترشح فعال آنتی بادی های موضعی IgA در ششها واعضاء بویایی وترشح موضعی IgG1 در ششها پس از عفونت باویروس آنفولانزای مرغی
می باشد.این آنتی بادی های موكوسی می تواند ایمنی موضعی در برابر عفونت مجدد پدید آورد .
واكسیناسیون مرسوم با یك واكن حاوی ویروس كامل غیر فعال به همراه ادجوانت بطور عمده پاسخ ایمنی سیستمیك با تولید IgA را تحریك می كند كه در برابرنومیا ایجاد مصونیت خواهد كرد. پیشرفت روش ایمنی زائی كه تولید IgA موكوسی را تحریك می كند ممكن است یك واكسیناسیون كارآمد را فراهم سازد .
آنتی بادی های IgA اختصاصی برای ویروس آنفولانزا برای دوره كوتاهی پس از عفونت قابل جداسازی هستند . بنابراین ، الیزای IgA برای تشخیص عفونت اخیر ویروس آنفولانزا می تواند استفاده شود . ( 7، صفحه 27)

قسمت چهارم :
واكسیناسیون وآنتی ویروسها

هیدروكلرید آمانتادین ویكی از آنالوگهای آن (ریمانتادین )داروهای ضد ویروسی برای كاربرد سیستمیك برای جلوگیری از آنفولانزای A هستند . این داروها پوشش زدایی ( uncoating) ویروس آنفولانزای A را در سلول میزبان مهار می كنند. عمل ضد ویروسی عمده عبارت است از مسدود كردن كانال یونی فعال شده بوسیله اسید از طریق پروتئین M2 ویروسی . موتانتهای مقاوم به دارو ایجاد شده وپخش می گردند . آمانتادین نسبتاً غیر سمی است ولی ممكن است سبب تحریك سیستم عصبی مركزی همراه با گیجی وبیخوابی خصوصاً درسالمندان گردد .
ریباویرین «یك آنالوگ نوكلئوزید صناعی » وانترفرون در موشها فعالیتهای ضد ویروسی بر علیه آنفولانزای A نشان داده اند ولی شواهدی از موثر بودن آنها در انسان در دست نمی باشد . تلاشهای منطقی برای طراحی دارو معطوف به مجموعه ترانس كریپتاز ویروسی است كه یك روند اختصاصی ویروس بوده و به مهار كردن حساس می باشد . ( fields, vol.2)
در ایالت متحده ، واكسنهای ویروس آنفولانزا كه بطور تجاری برای انسان ها ، اسبها وخوكها در دسترس هستند واكسنهای غیر فعال ویروس كامل یا تحت واحد می باشند . درحالی كه این واكسنها ممكن است میزان مرگ ومیر وشدت بیماری را كاهش دهند اما آنها نمی توانند یك مصونیت پایدار در مقابل عفونت پدید آورند : درمقابل ، بهبودی از عفونت تجربی با ویروسهای آنفولانزا در حیوانات یك مصونیت پایدار را در برابر برخورد مجدد با عامل بیماری پدید می آورد . ما درصدد فهم اساس ایمونولوژیك این نوع مصونیت برآمدیم وسعی در ساخت واكسنهایی كه در چنین سطحی بتوانند ایمنی زائی داشته باشند گردیم .
DNA واكسیناسیون شامل تجویز DNA پلاسمیدی است كه یك ایمونوژن راكد می كند كه دراین مورد ایمونوژن مورد نظر ما HA ویروسهای آنفولانزا بوده و به تجویز ایمونوژن به صورت پروتئینی ارجحیت دارد . DNA را می توان به روشهای مختلف تجویز كرد ، شامل تزریق parenteral ، استفاده درموكوس ، تلقیح با تفنگ ژنی در اپیدرم . یكی از بزرگترین امتیازات این حقیقت است كه آنی ژنها به صورت denovo « بدون الگو» در سلولهای عفونی شده ساخته می شوند وسپس می توانند هم به وسیله ملكوبهای MHCI وهم MCHI عرضه شوند وهمانطور كه ایمنی همورال را تحریك می كند ایمنی سلولی را نیز تحریك كنند فراتز از فراهم آوردن یك راه جدید به ایمنی زائی ، DNA واكسن همچنین یك ابزار قوی و مناسب برای تعدیل وفهم اساس پاسخهای ایمنی می باشد .
ما بر روی DNA واكسیناسیون برعلیه ویروسهای آنفولانزای مرغی وخوكی كار كردیم، با مطالعه بر روی موش شروع كردیم وسپس به اسب وخوكها منتقل كردیم در تعدادی از آزمایشاتمان DNA ، HAوپلاسمید دومی را كه IL-6 را به عنوان یك سیتوكاین ادجوانت كد می كرد تجویز كردیم .

بحث ونتایج :

آزمایشات اولیه مادر موش نشان داد كه وكسن اسبی از نوع HAو DNA یك مصونیت نسبی پدید می آرورد . كارآیی واكسن به میزان قابل توجه ای بوسیله تاخیر در زدن دوز یادآور از 3 تا 9 هفته افزایش پیدا می كند . ( 90% موش های واكسینه شده كاملاً مصون شدند . ) این موضوع شامل دیگر DNA واكسنها هم می شد كه با طولانی كردن زمان یادآوری مصونیت بالا می رود .
تجویز توأم DNA ، IL-6 انسانی + پلاسمید HA اسبی یك مصونیت كامل در موش پدید می آورد ، بطوری كه در ریه هیچ كدام از موشها هیچ ویروسی بعد از برخورد مجدد با ویروس قابل تشخیص نبود .
اضافه كردن IL-6 باعث افزایش آنتی بادی های اختصاصی ویروس درسرم ودر موكوس ( IgA ) ولی بطور غیر منتظره سطح IgA اختصاصی در ترشحات بینی افزایش پیدا كرد . نقش بالقوه IgA موكوسی در محافظت همچنین در مطالعات ما بر روی DNA واكسن در اسبها نیز مشخص شد . در یك مطالعه مقایسه ای DNA واكسیناسیون اسب در پوست + محلهای موكوسی « زبان وملتحمه » ، همینطور در موش ، مصونیت بر علیه ویروس با وجود IgA اختصاصی ویروس « IgGb » در ترشحات بینی وفقدان IgA قابل تشخیص همراه بود.
درمطالعات اولیه واكسیناسیون اسب بوسیله DNA ، HA + IL-6 « اسبی » حیوانات دوباره در حضور IgGb اختصاصی در سرم و ترشحات بینی مصون شدند اما درغیاب IgA در زمان برخورد مجدد باویروس .
هنوز ما از مطالعات گذشته می دانیم كه بهبودی از عفونت تجربی با ویروس آنفولانزا در اسبها پاسخ های قوی IgA بینی را القاء می كند . پس ، به این موضوع مهم باید توجه داشت كه احتمالاً DNA واكسنها به جای اینكه روند ایمنی زائی ساده ویروس را تقلید كنند از طریق مكانیسمهای منحصر به فردی ایجاد مصونیت می كنند .
در مطالعات اولیه بر روی خوكها ما یك دوز پایین از DNA واكسن را بكار بردیم . همانطور كه در اسبها ، تجویز DNA از طریق سطوح موكوسی بهتر از واكسیناسیون در پوست بود اما حیوانات قبل از برخورد مجدد با ویروس هیچ تغییر سرمی را نشان ندادند و در مقابل ویروس ایمن نشدند .
اما جالب است كه خوكها كه بوسیله DNA واكسینه شدند بعد از برخورد مجدد پاسخهای قوی آنتی بادی HI را نشان دادند . پس ، یك راهی كه ما بطور رایج می توانیم برای مصون كردن خوكها بكار بریم تجویز DNA واكسن وسپس یادآوری آنها با یك واكسن پروتئینی مرسوم می باشد .
بعلاوه ، مطالعات با آزمایش دوزهای بالاتر وطرق مختلف واكسیناسیون DNA واكسن و بررسی پاسخهای ایمنی دنبال گردید .
مصون سازی جوجه ها بوسیله ویروس آنفولانزای مرغی غیر فعال و واكسنهای نوتركیب آبله پرندگان از آنفولانزای بسیار بیماریزای H5 از جنبه تغییرات ژنتیكی در ویروسهای مزارع در طول سالها .
بطور مرسوم ، كنترل آنفولانزای مرغی بسیار پاتوژن « HPAI » از طریق تدابیر سركوب كنندگی صورت می گیرد . استفاده از واكسن به برنامه های كنترلی در برابر آنفولانزای با بیماریزایی متوسط در مرغابی های Midwestern ایالت متحده محدود می شود واخیراً نیز بر علیه HPAI در پاكستان ومكزیك انجام می گیرد .
در USA ، سرویس حفاظت سلامتی گیاهان وحیوانات (APHIS ) یك استراتژی را برای كنترل HPAI در آینده تنظیم كرده است كه می تواند شامل استفاده از واكسن دریك برنامه چند جانبه ریشه كنی می باشد .
در انسانها، واكسنهای تری والان غیر فعال برای كنترل وپیشگیری تیپهای A,B آنفولانزا مورد استفاده قرار می گیرند اما بدلیل تغییرات آنتی ژنتیكی ، واكسنها دارای عمر مفید محدودی هستند وتركیب آنها تصمیم گرفته شده كه هر ساله تنظیم شود .
سیر مطالعات به این جهت كشیده شده كه تعیین كنند آیا لازم است كه واكسنهای برعلیه HPIV H5 بطور مكرر برای فراهم آوردن یك مصونیت كافی تغییر پیدا كند .

مواد روشها :

آزمایش 1- گروههای 10 تایی از جوجه های سفید Leghorn 4 هفته عاری از پاتوژن اختصاصی بطریقه زیر جلدی با هریك از 12 كاندید واكسنهای غیر فعال AI ، ایمن شدند . واكسنهایی كه استفاده شدند شامل یك مایع تخم تلقیح نشده ، یك H7AIV ده H5AIV بودند . برخورد با ویروس 3 هفته بعد از واكسیناسیون ( PV ) بوسیله تلقیح داخل بینی ( IN) به میزان 7/7 10 ELD50 از ویروس HP Chick/Que/14588/95AIV صورت گرفت . نمونه سوآپ از دهان وگلو و كلوآك در زمان حداكثر ریزش ویروس گرفته شد ، 3 روز بعد از تلقیح ( PI ) ، برای جداسازی ویروس آن را در جنین 10 روزه تخم مرغ كشت دادیم . توالی آمینواسیدی مشهور HA1 برای واكسن و ویروسهایی كه برخورد مجدد با آنها داشتند تعیین شد.
آزمایش 2-90 تا جوجه SPF WL یك روزه با یك واكسن حامل نوتركیب آبله پرندگان حاوی یك ژن HA اضافه شده از Turkey/Ireland/83(H5) « وكتور HA » ایمن شدند . 90 جوجه نیز با وكتور آبله پرندگان « وكتور كنترل » ایمن شدند .
در هفته سوم ، 10 تا از جوجه های ایمن شده با وكتور – HA و 10 تا از جوجه های ایمن شده با وكتور كنترل بصورت IN با 250 دوز كشنده جوجه از 1 تا HP AIV9 مختلف تلقیح شدند ( جدول 2 ) نمونه ها مشابه مانند بالا گرفته شدند .

نتایج :

آزمایش 1- قطعه HA1 از پروتئین HA از ویروسهای واكسن H5 دارای 100%- 8.96از آمینواسید های مشهور مشابه با HA1 از HP H5 AIV بودند . برای گروههای واكسن H5، بیشتر جوجه های ایمن شده فاقد علائم كلینیكی بودند و بعد از مواجه با HPAI H5 AIV زنده ماندند . گروههای واكسن Sham ,H7 دارای 100% بیماری و و 90% مرگ ومیر بعد از مواجه با ویروس مشابه با گروههای بالا بودند . AIVدر 83% جوجه های با التهاب حفره گلو دهانی از 12 گروه در روز سوم PI جدا شد .
تیترAIV بدست آمده 305-103 10ELD50/ml از محیط كمتر برای واكسنهای H5 همانطور كه با گروههای sham یا H7 مقایسه شد . AIV از كلوآك جوجه های ایمن شده با H5 كمتر جدا شد ( 20% ) وقتی كه با گروههای ایمن شده با sham ,H7 (60%) مقایسه گردید . تیتر ویروس برای تمامی نمونه های كلوآك پایین بود . آزمایش 2- قطعات HA2,HA1 از پروتئین HA دارای 87.3-100%توالی آمینو اسیدی مشهور مشابه بین 9 برخورد مجدد AIV و ویروس واكسن وكتور – HA بود . واكسن نوتركیب آبله پرندگان H5 یك مصونیت كامل را در برابر مرگی كه به دنبال برخورد با نه H5 HP AIV رخ می داد شدند . گروههای كنترل دارای ویروسهای جدا شده از اوروفارنیكس « 90% » و « 88% » كلوآك بودند. گروههای وكتور –HA حذف شدند یا به حداقل رسانده شدند ، AIV از كلوآك در 9 گروه واز اوروفارنیكس در تمام گروهها به جز chicken/Queretaro/14588/959 chicken/PA/1370/83 (7، )

بحث :

داده ها نشان می دهند كه تغییرات مكرر واكسنهای H5 AI ممكن است برای پدید آوردن یك مصونیت كامل از بروز علائم كلینیكی ومرگ دراثر ویروسهای مزارع ضروری نباشد . ایمن زائی با این واكسنها باید ریزش AIV رااز اروفارینكس و كلوآك جوجه هایی كه در معرض AIV قرار گرفته اند كم كند . لیكن ، ویروسهایی كه دارای 90% همولوژی در HA با واكسن هستند و در معرض مجدد ویروس قرارمی گیرند ممكن است كه در ریزش AIV از اوروفارنیكس كاهش نشان ندهند . محافظت از موش با زانامیویر و ریمانتادین بعد از عفونت در موشهای عفونی شده با ویروس A/Hong Kong/156/97( H5N1 ) با زانامیویر و ریمانتادین

مقدمه :

به دلیل اینكه ویروس بسیار پاتوژن A/Hong Kong /156/97(H5N1 ) دارای شیفت آنتی ژنی در آنتی ژنهای سطحی HA ,NA می باشد واكسنهایی كه هنگام شیوع این ویروس استفاده شد قادر به مصون سازی نبود . آمانتادین وریمانتادین برعلیه عفونت ها و ویروسی آنفولانزا A موثر هستند . لیكن ، استفاده از این دارو ها بوسیله ظهور سریع موتانت های مقاوم به دارو و عوارض جانبی خود داروها محدود می گردد. یك داروی جدید ضد آنفولانزا، زانامیویر، نشان داده شده كه برعلیه عفونت آنفولانزای A,B در موش ، موش صحرائی وانسانها موثر می باشد وبخوبی تحمل می شود .لیكن ، علی رغم پتانسیل بالای زانامیویر بر علیه NA ویروسهای آنفولانزای بسیار پاتوژن در in vitro ، دارد قادر به محافظت جوجه ها برعلیه تعدادی از سویه های طاعون پرندگان نمی باشد .
این مسئله برای تحقیق مهم می باشد كه چگونه زانامیویر برعلیه این سویه بخصوص ویروس در سیستم پستانداران موثر می باشد .

بحث :

در این مطالعه ما عفونت آنفولانزای (H5N1) HK/97 را در مدل پستانداری وایجاد كردیم ونشان دادیم كه تجویز داخل بینی zZanamivir وتجویز دهانی ریمانتادین باعث ایجاد محافظت در برابر عفونتهای كشنده می كند این موضوع بوسیله سه شاخص كنترل گردد:
كاهش در تیترهای ویروسی شش ، كاهش در بیماریزائی كه از طریق كاهش وزن بررسی گردید ، وكاهش در مرگ و میر هم بطور مطلق از طریق تعدادآنهایی زنده اند وهم بوسیله كنترل زمان بین عفونت ومرگ بعنوان MSD یا میانگین طول روزهای عمر . این داده ها دلایل منطقی را برای مطالعات بعدی بر روی زانامیویر وداروهای وابسته در درمان ویروسهای آنفولانزای مرغی با قدرت عبور از سدهای بین گونه ها وبیماریزائی در پستانداران فراهم آورد .
لیكن باید به خاطر داشت كه داده های گزارش شده در اینجا برای پیشگیری ودرمان بیماری ممكن است منعكس كننده غلبه این دارو درزمان تاخیر در درمان نباشد .
ایمونوژنسیته گلیكوپروتئین های آنفولانزا با فرمهای مختلف سازماندهی سوپر ملكولی راهی كه یك Ag به سیستم ایمنی عرضه می شود اغلب برای دستیابی به پاسخ ایمنی عملی تعیین كننده می باشد . نشان داده شده كه یك Ag می تواند وقتی كه در یك حالت مجتمع ، به فرم كلوئیدی برای مثال بعنوان مسیل پروتئین عرضه گردد بیشتر آنتی ژنتیك می گردد.
گلیكوپروتئین های قابل حل Envelop ویروس آنفولانزا بر روی كمپلكس های ملكولی مختلف مانند مسیلها ، لیپوزمها و ISCOM ها از طریق بر هم كنش های هیدروفوبیك دمین ها انتقالی غشاء راحت تر سوار می شوند .
بنابراین تغییر فرم سوپرملكولی گلیكوپروتئین جدا شده یكی از راههای احتمالی برای افزایش ایمونوژنسیته می باشد .
هدف از این مطالعه تحقیق بر روی فعالیت ایمونوژنیك ساختمانهای آنتی ژنی مختلف ( میسل ها ، ISCOM ها ) تهیه شده از آنتی ژنهای گلیكوپروتئین ویروس آنفولانزا می باشد ( سویه A/FPV/Rostock/34 ) .( 7، صفحه 68)

بحث :

نتایج بدست آمده نشان می دهد كه فرمهای مختلف ملكولی آنتی ژن سطوح مختلف ایمنی همورال را تحریك می سازد . ISCOM ها بهترین فرم تحریك كننده سیستم ایمنی از گلیكوپروتئین های خالص FPV است كه سطح بالایی از ایمنی همورال را نسبت به میسل گلیكو پروتئین ها تحریك می سازد . ISCOM ها همچنین یك سطح بالایی از آنتی بادی ها را در زرده تخم مرغ تحریك می سازند.
تیتر آنتی بادی زرده تخم مرغ مرتبط با سطح آنتی بادی های سرم می باشد .

كارآیی ریمانتادین در برابر آنفولانزای پرندگان :

آنفولانزای مرغی درفرم كلاسیك طاعونی (FCP)به ندرت پدید می آید .لیكن ، در تعدادی از كشورهای دنیا این عفونت بوسیله شیوعهای epizootic ظاهر می شود ، كه توسط سویه های ویروس آنفولانزا از دیگر تحت تیپها ، كه بوسیله بیماریزایی كم در مقایسه با ویروس FCP مشخص می شدند . بیماریهای تنفسی بویژه اپیزوتیك های آنفولانزا میان جوجه ها ، معمولاً با بیماریهای اپیدمیك در میان مردم همزمان می شد یا اینكه كمی بعد از آن رخ می داد . مكرراً این ویروسهای تغییر یافته آنفولانزا از جوجه های عفونی شده وپرندگان synanthropic كه باعث بیماری در آنها می شود جدا شده اند وبا آنتی ژنهای واقعی برای انسان مشابهت داشت .

نتایج :

بعد از بكار بردن ریمانتادین در روزهای 5 تا7 درمان ، علائم كلینیكی آنفولانزا ناپدید گشت میزان تلفات پرندگان به میزان 3و8% كاهش پیدا كرد. تیتر آنتی بادی های اختصاصی در 5 و2% از سرمهای تست شده یافته شد ، درحالی كه درگروه جوجه های درمان شده با اریترومایسین این درصد 21% می باشد . اثر درمانی ریمانتادین برعلیه آنفولانزای پرندگان 85و7% ساختگی می باشد .

بحث :

نتایج بدست آمده تاثیر بالای درمانی ریمانتادین را در طول درمان آنفولانزا در پرندگان در مقایسه با اریترومایسین تایید می كند . با استفادهاز روش اسپری كردن ریمانتادین میزان مورد استفاده كمتر می شود وقیمت تمام شده نیز كمتر می گردد و كارآیی نیز بالا می رود .

شناسایی وتحت تیپ بندی ویروسهای آنفولانزای مرغی بوسیله RT-PCR :

ویروس آنفولانزای مرغی بوسیله RT-PCR با استفاده از یك سری پرایمرهای اختصاصی برای ژن نوكلئوپروتئین ( NP ) ویروس آنفولانزای مرغی صورت
می گیرد.
تحت تیپهای HA ویروس آنفولانزای مرغی بوسیله انجام همزمان 15 واكنش RT-PCR تعیین می گردد ، هر كدام با استفاده از یك سری پرایمر اختصاصی برای یك تحت تیپ HA برای یك سویه تنهای ویروس یا جدا شده ، فقط یكی از 15 واكنش RT-PCR محصولات با اندازه ای كه انتظار داریم راتولید می كند و در نتیجه تحت تیپ HA ویروس آنفولانزا تعیین می گردد . نتیجه تحت تیپ HA سپس بوسیله بررسی توالی های محصولات PCR تایید می گردد. تمامی 80 سویه یاویروسهای آنفولانزای جدا شده بوسیله روش RT-PCR تحت تیپ بندی شدند ونتیجه RT-PCR یك انطباق عالی « 100% » با نتایج روش سرولوژیكی مرسوم داشت . این روش RT-PCR سری وحساس می باشد و می توان برای شناسایی وتعیین تحت تیپ HA ویروس آنفولانزای مرغی در ارگان هموژنه شده استفاده كرد .
1)Basic Information About Avian Influenza FACT SHEET , 2004.
2)Avian Influenza in Poultry1 UNIVERSITY of FLORIDA.
2)HIGHLY PATHOGENIC AVIAN…. Communicable Diseases network , 2004.
3)WHO interim guidelines on clinical ….2004.
4)Combined PCR – HeteroduPLex…
Jornal of Microbiology , 2001.
Neurovirulence in Mice of H5N1… ( 5
American Society fo Microbiology 2003.
6)INFLVENZA . A VIRUS ,H5N7 ,DUCKS – DENMARK , 2003
7)Symposium on Animal Influenza …..1999.
8)The evolution of H5N1 …. 2004.
9)Identification and subtyping of avian …
منبع: http://www.farsvet.ir
/خ